왕지네의 혈림프 내 면역세포의 동정 및 특성 분석 = Identification and Characterization of Immune Cells in the Hemolymph of the Chinese Red-headed Centipede(Scolopendra mutilans)

국문 초록 (Abstract)

절지동물은 지구상에서 가장 번성한 동물군으로서 강력한 선천성 면역(innate immunity) 체계를 통해 다양한 병원체로부터 자신을 방어한다. 그러나 곤충강이나 갑각강에 비해 계통분류학적으로 중요한 위치를 점하는 다지류, 특히 지네강(Chilopoda)의 세포성 면역 기작에 대한 연구는 미비한 실정이다. 본 연구는 동아시아에 널리 서식하며 약용 자원으로 활용되는 왕지네(Scolopendra mutilans)를 모델로 하여, 혈구세포의 안정적인 체외(In vitro) 배양 시스템을 확립하고, 형태학적 분류와 더불어 병원체의 물리적 특성에 따라 특화된 세포성 면역 반응을 규명하는 것을 목적으로 수행되었다.

연구 결과, Grace’s Insect Medium을 기반으로 한 최적화된 배양 조건에서 왕지네 혈구세포는 약 20일간 생존하며 정상적인 형태를 유지하였다. 광학현미경(DIC) 및 주사전자현미경(SEM)을 이용한 미세구조 분석을 통해 혈구세포는 크게 과립구혈구세포(granulocyte), 부정형혈구세포(plasmatocyte), 전혈구세포(prohemocyte)의 세 가지 유형으로 분류되었다. 정상 상태의 혈림프 내 세포 구성 비율(DHC)은 부정형혈구세포가 약 60.55%로 가장 우점하였으며, 과립구혈구세포(36.29%)와 전혈구세포(3.16%)가 그 뒤를 이었다. 그러나 대장균(Escherichia coli)을 체강 내 주입하여 면역 반응을 유도한 지 1시간 후에는 과립구혈구세포의 비율이 14.29%로 급격히 감소한 반면, 전혈구세포는 26.53%로 대폭 증가하는 역동적인 변화가 관찰되었다. 이는 감염 초기 단계에서 과립구혈구세포가 면역 작용에 소모되거나 조직으로 이동하고, 이를 보상하기 위해 전구세포들이 혈류로 방출되었음을 시사한다.

기능적 측면에서 왕지네의 혈구세포는 침입한 이물질의 크기에 따라 명확히 이원화된 방어 전략을 보였다. 첫째, 2 μm 크기의 Latex beads 및 대장균과 같은 미세 입자에 대해서는 과립구혈구세포가 주도적으로 식균 작용(phagocytosis)을 수행하였다. Lysotracker Red를 이용한 유세포 분석(FACS) 결과, 병원체 노출 후 1시간 시점에서 리소좀 활성이 활성화된 세포의 비율이 36.70%로 최고조에 달했으며, 이는 초기 과립구혈구세포의 존재 비율과 일치하여 해당 세포가 살균 작용의 핵심 주체임을 정량적으로 입증하였다. 둘째, 식균이 불가능한 120 μm 크기의 Sephadex beads에 대해서는 부정형혈구세포가 세포질을 넓게 확장하여 표면을 감싸는 피포 형성(encapsulation)을 주도하였으며, 주변의 과립구혈구세포들이 협력하여 결절(nodulation)을 형성하는 집단 면역 반응이 관찰되었다. 추가적으로 미세소관 억제제(colchicine, nocodazole) 처리 실험을 통해, 이러한 혈구세포의 탐색, 포식, 피포 형성 과정에 세포 골격의 중합 및 해체가 필수적인 기작임을 생화학적으로 검증하였다.

결론적으로 본 연구는 미개척 분야였던 왕지네의 세포성 면역 체계가 과립구혈구세포 중심의 즉각적인 식균 작용과 부정형혈구세포 중심의 물리적 봉쇄라는 정교한 역할 분담을 통해 이루어짐을 밝혔다. 이러한 결과는 절지동물 면역 시스템의 진화적 연결 고리를 이해하는 데 중요한 기초 자료를 제공할 뿐만 아니라, 향후 지네 유래 면역 물질 탐색 및 생체 방어 기전 연구에 기여할 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Arthropods, the most diverse animal group on Earth, rely on a potent innate immune system to defend against various pathogens. However, compared to Insecta or Crustacea, research on the cellular immune mechanisms of Chilopoda (centipedes), which occupy a phylogenetically significant position, remains insufficient. This study utilized Scolopendra mutilans, a widely distributed species in East Asia used as a medicinal resource, to establish a stable in vitro hemocyte culture system, classify hemocyte types morphologically, and elucidate cellular immune responses specialized according to the physical characteristics of pathogens.

Under optimized culture conditions based on Grace’s Insect Medium, S. mutilans hemocytes maintained viability and normal morphology for approximately 20 days. Microstructural analysis using differential interference contrast (DIC) microscopy and scanning electron microscopy (SEM) classified the hemocytes into three major types: Granulocytes, Plasmatocytes, and Prohemocytes. In the naive hemolymph, the differential hemocyte count (DHC) showed that Plasmatocytes were the most predominant (60.55%), followed by Granulocytes (36.29%) and Prohemocytes (3.16%). However, one hour after an intra-hemocoelic injection of Escherichia coli, a dynamic shift was observed: the proportion of Granulocytes decreased significantly to 14.29%, while Prohemocytes increased to 26.53%. This suggests that Granulocytes are rapidly consumed or recruited to tissues during the initial immune response, prompting a compensatory release of progenitor cells into the circulation.

Functionally, the hemocytes demonstrated a clear dual defense strategy depending on the size of the foreign intruder. First, against micro-particles such as 2 μm latex beads and E. coli, Granulocytes predominantly performed phagocytosis. Flow cytometry analysis using LysoTracker Red revealed that the proportion of cells with activated lysosomes peaked at 36.70% one hour post-exposure, a figure consistent with the initial Granulocyte ratio, quantitatively identifying them as the primary effectors of bactericidal activity. Second, against large targets such as 120 μm Sephadex beads, Plasmatocytes initiated encapsulation by extensively spreading their cytoplasm, while surrounding Granulocytes cooperated to form nodules. Furthermore, experiments using microtubule inhibitors (Colchicine and Nocodazole) biochemically verified that cytoskeletal polymerization and depolymerization are essential mechanisms for cell migration, phagocytosis, and encapsulation.

In conclusion, this study reveals that the cellular immune system of S. mutilans operates through a sophisticated division of labor: Granulocyte-mediated immediate phagocytosis and Plasmatocyte-mediated physical containment. These findings provide fundamental data for understanding the evolutionary links of arthropod immunity and establish a basis for future research on centipede-derived immune substances and biological defense mechanisms.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 4
• 1. 장기간 세포배양 조건 확립 4
• 2. 왕지네 혈구세포 형태학적 특성과 세포 구성 비율 확인 5
• 3. 대장균 및 Latex Beads에 의한 초기 반응과 식균 작용 6
• 4. Lysotracker Red를 활용한 세포의 리소좀 활성화 관측 6
• 5. 유세포 분석을 이용한 시간별 면역 활성 분석 7
• 6. Sephadex Beads를 이용한 추가적 면역반응 유도 7
• 7. 미세소관 억제제를 이용한 세포 면역 억제 8
• Ⅲ. 결과 9
• 1. 왕지네 혈구세포의 형태학적 특성 및 세포 구성 비율 9
• 2. 대장균 노출에 따른 혈구세포의 초기 반응 14
• 3. Latex Beads를 이용한 식균작용(phagocytosis) 규명 16
• 4. Lysotracker Red를 이용한 리소좀 활성화 검증 18
• 5. 유세포분석(FACS)을 통한 면역 활성 시간별 정량 분석 20
• 6. Sephadex Beads에 의한 피포 및 결절 형성 23
• 7. 미세소관 억제제가 혈구세포의 형태 및 면역 기능에 미치는 영향 25
• Ⅳ. 고찰 27
• Ⅴ. 참고문헌 31
• Ⅵ. Abstract 37