수박과실썩음병(BFB) 병원균 Acidovorax citrulli 병원성 분석 및 Bacillus velezensis 및 PAW 기반 방제 효과 연구 = Study of Acidovorax citrulli Pathogenic Factors, and Antagonistic and PAW-based Control Effects of Bacterial Fruit Blotch (BFB) on Watermelon

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 국내 8개 도에서 수집한 수박 재배지 토양의 미생물 다양성을 분석하고, 수박 과실썩음병(Bacterial Fruit Blotch, BFB)의 병원균인 Acidovorax citrulli의 분리, 동정 및 병원성 특성을 규명하였다. 92개 토양 시료에 대한 16S rRNA 시퀀싱 결과, 모든 샘플에서 신뢰도 높은 read count가 확보되었으며, 지역 간 미생물 군집의 다양성과 구조적 차이가 확인되었다. 특히 KN 지역은 군집 구조가 유사하고 다양성이 낮았으며, CB 지역은 높은 다양성과 이질성을 보였다. 수박 재배지에서 총 2,702개의 세균을 분리하였고, 간이진단 및 PCR, 16S rRNA 분석을 통해 BFB 병원균 2주(HPP21-3-3B, HPP21-9-4B)를 동정하였다. 병원성 검정 결과, ㈜더기반에서 분양받은 140 균주가 가장 높은 발병률을 나타냈으며, 이를 대상으로 Tn5를 이용한 random mutation을 수행하여 병원성이 감소된 mutant 균주(140RM2-6A4B, 140RM2-7A2B)를 선발하였다. 선발된 mutant 균주의 유전체 분석을 통해 flhB 및 ompA 유전자의 결실이 확인되었으며, 이는 병원성 감소와 관련이 있는 것으로 추정된다. 또한 qRT-PCR 분석을 통해 수박 저항성 유전자(MKK3, JAZ 등)의 발현이 mutant 균주 접종 시 증가함을 확인하였고, 이는 flhB 유전자가 수박의 jasmonic acid 신호전달 경로를 억제하여 병 발생을 유도함을 시사한다.
BFB 병원균에 대한 길항성 미생물 선발 및 대기압 플라즈마 처리수(Plasma-Activated Water, PAW)의 항균 효과를 평가하였다. 대치 배양을 통해 전국 6개 지역에서 총 28종의 길항균주를 분리하였으며, 이 중 Bacillus velezensis가 가장 높은 빈도로 확인되었다. 선발된 균주 중 TIPL-6-1B 및 TIPL-8-1B는 BFB 병원균 140에 대해 가장 강한 길항 효과를 나타냈다.
생화학적 특성 분석 결과, 대부분의 균주가 protease, ammonia, siderophore 생성 능력을 보였으며, phosphate 가용화 및 starch 분해 능력도 일부 균주에서 확인되었다. 그러나 chitinase 생성은 모든 균주에서 관찰되지 않았다. 유전체 분석을 통해 TIPL-6-1B와 TIPL-8-1B 균주에서 surfactin, bacilysin, fengycin, bacillaene, bacillibactin 등 주요 2차 대사산물 생합성 유전자가 확인되었으며, TIPL-6-1B △Als mutant를 통해서 병원균에 대한 길항 활성과 관련된 것으로 판단된다. 또한, PAW의 항균 효과를 평가한 결과, BFB 병원균은 처리 시간에 따라 생장이 억제되었으며, 특히 PAW-30m 처리구에서 높은 살균 효과가 확인되었다. 반면, 선발된 길항균주는 PAW 처리에도 생장이 유지되어 내성을 보이는 것으로 나타났다. 이는 PAW와 길항균의 병용 처리가 수박 BFB 방제에 효과적인 전략이 될 수 있음을 시사한다.
흑피계 및 호피계 수박 품종을 대상으로 육묘 및 포장 실증 실험을 수행하여 PAW와 길항균의 혼합 처리 효과를 검증하였다. 육묘 단계에서는 PAW 30분 + TIPL-6-1B 처리구가 흑피와 호피 모두에서 가장 낮은 disease index(1.56, 0.67)를 기록하였으며, 호피 품종이 길항균과 PAW 조합에 더 민감하게 반응하는 경향을 보였다. 포장 실증 실험에서는 TIPL-6-1B가 선처리(pre-inoculation) 조건에서 병원균의 초기 침입을 억제하며 착과율 향상에 기여하였고, TIPL-8-1B는 후처리(post-inoculation) 조건에서 병 증상의 확산을 억제하는 효과를 나타냈다. 간이진단 및 PCR 분석에서도 BFB 병원균의 감염 억제 효과가 입증되었으며, 특히 PAW-20m + TIPL-8-1B 및 PAW-30m + TIPL-6-1B 처리구는 포장 실험에서도 가장 낮은 disease index를 기록하였다(1.3, 0.7).
종합적으로 본 연구는 수박 재배지의 토양 미생물 생태계 이해를 바탕으로 BFB 병원균의 병원성 인자 및 수박 저항성 유전자 간의 상호작용을 규명하였으며, PAW와 길항균을 활용한 생물학적 방제 전략의 실효성을 실증하였다. 특히 품종별 생리적 특성과 처리 시점에 따른 길항균의 작용 메커니즘 차이가 병 억제 효과에 영향을 미친다는 점을 확인하였으며, 이는 향후 수박 병 방제 기술 개발 및 지속가능한 농업 실현에 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This study aimed to analyze the microbial diversity of watermelon cultivation soils across eight provinces in Korea and to identify, characterize, and evaluate the pathogenicity of Acidovorax citrulli, the causal agent of Bacterial Fruit Blotch (BFB) on watermelon. A total of 92 soil samples underwent 16S rRNA sequencing, yielding highly reliable read counts across all samples. The analysis revealed distinct differences in microbial community structure and diversity between regions. Notably, samples from the KN region exhibited low diversity and homogeneity, whereas those from the CB region showed high heterogeneity and richness. From the watermelon cultivation sites, 2,702 bacterial isolates were obtained, and two BFB strains (HPP21-3-3B and HPP21-9-4B) were identified through immunoassay, PCR, and 16S rRNA sequencing. Among these and isolate 140 received from The Givan Co., isolate 140 demonstrated the highest pathogenicity. Tn5-based random mutagenesis was performed on strain 140, resulting in the selection of two mutant strains (140RM2-6A4B and 140RM2-7A2B) with significantly reduced pathogenicity. Whole genome analysis of the selected mutants revealed deletions in the flhB and ompA genes, which are presumed to be associated with the observed reduction in virulence. Furthermore, qRT-PCR analysis showed increased expression of watermelon resistance-related genes (MKK3 and JAZ) upon inoculation with the mutant strains. These findings suggest that the flhB gene may suppress the jasmonic acid (JA) signaling pathway in watermelon, thereby facilitating disease development.
To selection the antagonistic microorganisms against BFB were screened, and the antimicrobial efficacy of Plasma-Activated Water (PAW) was evaluated. A total of 28 antagonistic strains were isolated from six regions, with Bacillus velezensis being the most frequently identified species. Among the selected strains, TIPL-6-1B and TIPL-8-1B exhibited the strongest antagonistic activity against BFB strain 140. Biochemical characterization revealed that most isolates produced protease, ammonia, and siderophores, while phosphate solubilization and starch degradation were observed in some strains. However, none of the isolates produced chitinase. Genome analysis of TIPL-6-1B and TIPL-8-1B confirmed the presence of key biosynthetic genes for secondary metabolites such as surfactin, bacilysin, fengycin, bacillaene, and bacillibactin, which are known to contribute to antimicrobial activity. PAW treatment showed time-dependent inhibition of BFB growth, with the 30-minute treatment exhibiting the highest bactericidal effect. In contrast, the selected antagonistic strains maintained growth under PAW exposure, indicating resistance and suggesting that combined PAW and microbial treatments may offer a synergistic strategy for BFB control. Seedling and field validation experiments were conducted using two watermelon cultivars: Black and Striped. The combined treatment of PAW and antagonistic strains significantly reduced disease incidence compared to PAW alone. In seedling, the PAW 30-minute + TIPL-6-1B treatment resulted in the lowest disease index for both cultivars (1.56 for Black and 0.67 for Striped), with Striped showing greater sensitivity to the combined treatment. Field trials demonstrated that TIPL-6-1B was most effective when applied as a pre-inoculation treatment, enhancing fruit set and preventing initial pathogen invasion. TIPL-8-1B, when applied post-inoculation, effectively suppressed disease progression. Diagnostic assays and PCR confirmed the suppression of BFB infection in treated groups, with PAW-20m + TIPL-8-1B and PAW-30m + TIPL-6-1B treatments showing the lowest disease index (1.3 and 0.7, respectively).
In conclusion, this study provides a comprehensive understanding of the soil microbial ecology in watermelon cultivation and elucidates the interaction between BFB pathogenicity factors and host resistance genes. The demonstrated efficacy of PAW and antagonistic microbial treatments offers a promising biological control strategy. The differential responses observed between cultivars and treatment timings highlight the importance of tailored approaches in disease management. These findings contribute valuable insights for the development of sustainable agricultural practices and effective BFB control technologies.

목차 (Table of Contents)

• 제1장 수박 재배지로부터 BFB 균주 분리 및 A. citrulli의 유전적 특성 1
• 1. 서 론 1
• 2. 재료 및 방법 5
• 1) 수박 재배지 토양 수집 및 Microbiome 분석 5
• 2) Acidovorax citrulli 분리 및 병원성 검정 6
• (1) A. citrulli 순수분리 및 간이진단 6
• (2) PCR 검정 및 동정 7
• 3) BFB 균주의 수박에 대한 병원성 검정 9
• 4) Tn5를 이용한 BFB 균주의 Random mutation 및 병원성 검정 11
• 5) 선발 Random mutant 균주의 De novo sequencing 12
• 6) Random mutant 균주 접종 수박의 qRT-PCR 13
• (1) Primer 선발 및 효율성 검정 13
• (2) qRT-PCR 검정을 통한 수박 저항성 관련 유전자 발현 검정 15
• 3. 결과 및 고찰 16
• 1) 수박 재배지 토양 미생물군의 다양성 16
• (1) OTU (Operational Taxonomic Unit) 16
• (2) Taxonomic assignment 18
• ① Phylum level 18
• ② Class level 18
• ③ Order level 19
• ④ Family level 19
• ⑤ Genus level 19
• ⑥ Species level 20
• (3) Community richness & diversity 21
• (4) PCoA graph 23
• (5) UPGMA tree 25
• 2) 수박과실썩음병 병원균(A. citrulli) 분리, 동정 및 병원성 분석 28
• (1) 수박 재배지의 토양 및 식물체 수집 및 세균 분리 28
• (2) 간이진단, PCR 검정 및 16S rRNA 동정을 통한 BFB 균주 선발 29
• (3) BFB균의 병원성 검정(In vitro) 31
• 3) Tn5 random mutant 균주의 병원성 검정 33
• 5) Random mutant 균주의 수박 접종을 통한 수박 저항성 유전자의 발현량 검정 41
• (1) 수박 저항성 유전자 Primer 선발 41
• (2) qRT-PCR 분석을 이용한 수박 저항성 관련 유전자 발현량 확인 43
• 제2장 길항미생물 및 PAW의 수박과실썩음병원균 억제 효과 47
• 1. 서 론 47
• 2. 재료 및 방법 50
• 1) 길항 미생물 분리, 선발 및 동정 50
• 2) 선발 길항균의 생화학적 검정 및 유전체 분석 51
• (1) 선발 길항균 28종의 생화학적 검정 51
• (2) 선발 길항균 TIPL-6-1B 및 TIPL-8-1B의 De novo sequencing 52
• 3) 선발 길항균주(TIPL-6-1B)의 접합형질전환을 이용한 mutnat 균주 제작 53
• (1) TIPL-6-1B 균주의 접합형질전환을 위해 사용된 균주, plasmid, primer 정보 53
• (2) TIPL-6-1B (B. velezensis) 균주 배양 및 DNA 추출 PCR을 통한 DNA fragments 증폭 54
• (3) Plasmid vector의 재조합 및 화학적 형질전환 55
• (4) Plasmid 추출 및 Electroporation 55
• (5) Bacterial conjugation 56
• (6) TIPL-6-1BAls의 A. citrulli 길항성 검정 56
• 4) 대기압 플라즈마를 이용한 플라즈마활성수(PAW) 제조 및 길항미생물에 대한 영향 검정 57
• (1) 플라즈마활성수(PAW) 제조 57
• (2) 플라즈마활성수(PAW)의 pH 측정 59
• (3) PAW의 A. citrulli 및 선발 길항균의 생장 억제 검정 59
• 3. 결과 및 고찰 60
• 1) 길항균주 분리 및 선발 60
• 2) 선발 길항균의 생화학적 검정 및 유전체 분석 62
• (1) HCN 생성 여부 확인 62
• (2) Protease 생성 여부 확인 63
• (3) Ammonia 생성 여부 확인 64
• (4) Phosphate 가용화 여부 확인 65
• (5) Starch 가수분해 여부 확인 66
• (6) Siderophore 생성 여부 확인 67
• (7) Chitinase 생성 여부 확인 68
• 3) 선발한 2개 길항균의 유전체 분석 70
• 4) TIPL-6-1BAls mutant 제작 및 길항 여부 확인 73
• (1) Flank fusion (Cross-Over) PCR을 통한 Als gene의 삭제 73
• (2) E. coli 및 B. velezensis의 Conjugation 74
• (3) TIPL-6-1BAls의 길항 효과 76
• 5) PAW의 BFB 균주 억제 및 길항 미생물에 대한 영향 검정 77
• (1) PAW의 pH 변화를 통한 지효성 확인 77
• (2) PAW의 BFB 균주 및 선발 길항균에 대한 생장 억제 효과 79
• 제3장 길항미생물 및 PAW 처리 수박의 BFB 방제 효과 81
• 1. 서 론 81
• 2. 재료 및 방법 83
• 1) PAW 및 길항균 혼합 처리 수박 육묘의 BFB 접종(In vitro) 83
• 2) 수박 포장 실증을 통한 BFB 균주에 대한 길항균의 방제 효과 검정 84
• (1) 수박 파종 및 정식 84
• (2) BFB 및 길항 균주 인공 접종 86
• (3) Aac Immouno Strip Kit를 통한 간이진단 검사 87
• (4) 채종 종자의 PCR 검정 88
• 3) PAW 및 길항균 수박 접종 처리를 통한 포장에서의 BFB 방제 효과 검정 88
• 3. 결과 및 고찰 89
• 1) PAW 및 길항균 혼합 처리 수박 육묘의 수박과실썩음병 발병도 확인 89
• 2) 수박 포장 실증을 통한 BFB 균주에 대한 길항균의 방제 효과 검정 92
• (1) 수박 인공접종 종자 채종 및 착과수 92
• (2) 수박 채종 종자 및 씨방의 BFB 감염 간이진단 및 PCR 검정 94
• 3) 플라즈마수 및 길항균 수박 접종 처리를 통한 포장에서의 BFB 방제 효과 검정 98
• 참고 문헌 101
• Abstract 114