셀룰로오스 아세테이트의 생분해를 위한 키틴 탈아세틸화 효소와 셀룰로오스 결합 모듈과의 융합 단백질 개발 = Development of a Fusion Protein Combining Chitin Deacetylase and Cellulose-Binding Module for the Biodegradation of Cellulose Acetate

국문 초록 (Abstract)

셀룰로오스 아세테이트(Cellulose acetate, CA)는 플라스틱 소재 중 하나로 셀룰로오스의 수산기를 아세틸기로 치환한 유도체로 뛰어난 기계적·화학적 특성으로 인해 다양한 산업체 분야에서 폭넓게 활용되고 있다. 그러나, 상업용으로 이용되는 CA는 높은 치환도(DS≥2.5)를 가져 자연환경에서 분해가 어려운 난분해성 고분자로 분류된다. 특히, 매립 환경에 장기간 방치된 CA는 미세 플라스틱으로 분해되는 과정에서 아세트산이 방출되어 2차 환경오염을 초래할 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 CA 내 에스터 결합을 생물학적으로 절단하여 셀룰로오스와 아세트산으로 분리하는 전략은 원료 성분의 재활용이 가능하다는 점에서 주목 받고 있다.
본 연구에서는 CA와 구조적 유사성을 가지는 키틴의 탈아세틸화 반응을 수행하는 키틴 탈아세틸화 효소인, 효모 유래 키틴 탈아세틸화 효소(ScCDA1)를 적용하여 CA의 탈아세틸화 반응을 유도하고자 한다. ScCDA1의 고효율 생산을 위해 대장균 기반의 발현 시스템을 구축하였으며, 발현 카세트 내 융합 태그의 도입을 통해 가용성 발현율을 60% 이상 개선하였다. 생산된 ScCDA1은 친화 크로마토그래피법을 통해 80% 이상의 순도로 정제되었으며, 정제 ScCDA1의 최적 온도, pH, 활성 촉진 인자 그리고 다양한 화학적 첨가제가 효소 활성에 끼치는 영향을 확인하였다. 그 결과, ScCDA1은 40°C, pH 8 그리고 1 mM의 Mn2+을 첨가하였을 때 최적 활성을 나타내었다. 또한 ScCDA1은 환원제(DTT, 2-ME)와 금속 킬레이트(EDTA)에 의해 대부분의 활성이 소실되었으며, 계면활성제(SDS)에서는 일부 활성을 유지할 수 있음이 확인되었다.
나아가, ScCDA1의 CA 표면 접근성을 향상시키기 위해 Cellulose Binding Module 4 (CBM4)와의 융합 단백질을 제작하고자 하였으며, 최적의 CBM4를 선정하기 위해 셀룰로오스 분해능이 우수한 Acetivibrio thermocellus 유래 11종의 셀룰로오스 결합 모듈를 AlphaFold 구조 모델링 및 DS 3.0 CA 삼량체와의 도킹 분석을 수행하였다.
선정된 AtCBM4와 ScCDA1을 융합한 AtCBM4-ScCDA1 단백질은 E. coli를 통해 발현하였으며 최적 조건을 평가한 결과, AtCBM4와의 융합은 ScCDA1의 최적 조건과 동일한 것으로 확인하였다. 최적 조건에서의 활성은 AtCBM4-ScCDA1의 경우 대략 265.33 U/mg, ScCDA1의 경우 약 238.94 U/mg으로 확인되었다. 이와 같은 활성의 차이는 AtCBM4이 융합됨으로써 단백질 표면의 구조적 안정화를 유도하여 활성을 개선한 결과로 사료된다.
두 단백질을 높은 치환도의 CA (DS 2.5 및 3.0)와 함께 48시간 동안 반응을 수행한 결과, 수산기의 분포가 증가됨을 FT-IR 분석을 통해 확인하였다. 또한 13C-NMR 분석 결과에서도 두 단백질의 처리 시 아세틸기의 지표인 C=O 및 CH3 피크가 미처리군에 비해 감소되었으며, AtCBM4-ScCDA1 처리군에서 그 감소 폭이 ScCDA1 처리군에 비해 더 크게 관찰되었다. 이러한 결과는 AtCBM4 융합이 CA에 대한 접근성을 개선하여 탈아세틸화 효율을 효과적으로 상승시킬 수 있음을 입증한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Cellulose acetate (CA) is a cellulose-derived plastic in which native hydroxyl groups are substituted with acetyl groups, conferring excellent mechanical and chemical properties that enable extensive industrial use. However, commercially used CA typically possesses a high degree of substitution (DS ≥ 2.5), and the abundance of acetyl groups renders it highly recalcitrant to biodegradation in natural environments. Particularly under landfill conditions, prolonged environmental exposure can cause CA to fragment into microplastics, during which acetic acid may be released, potentially causing significant environmental pollution. As a result, biological cleavage of the ester bonds within CA, thereby converting it back into cellulose and acetic acid, has emerged as a promising strategy for material recycling. Nevertheless, previously reported esterases have been shown to exhibit significantly reduced deacetylation activity toward highly substituted carbonylacetyl (CA) groups.
In this study, we sought to induce the deacetylation of CA using a chitin deacetylase enzyme, based on the structural similarity between CA and chitin. A Saccharomyces cerevisiae derived chitin deacetylase, ScCDA1, was selected and its efficient production was achieved by establishing an E. coli based expression system. The incorporation of solubility enhancing fusion tags within the expression cassette improved soluble expression levels by more than 60%. The produced ScCDA1 was purified to over 80% purity via affinity chromatography, and its optimal catalytic conditions including temperature, pH, activating factors, and the effects of various chemical additives were characterized. ScCDA1 exhibited maximal activity at 40 °C, pH 8.0, and in the presence of 1 mM Mn²+. In contrast, most of its activity was lost in the presence of reducing agents (DTT, 2-ME) or the metal chelator EDTA, whereas partial activity was retained in the presence of the surfactant SDS.
To further enhance ScCDA1’s accessibility to the CA surface, we engineered a fusion protein containing Cellulose Binding Module 4 (CBM4). Eleven CBM4 candidates from Acetivibrio thermocellus, a cellulolytic bacterium, were evaluated through AlphaFold structural prediction and molecular docking analyses with a DS 3.0 CA trimer. The selected AtCBM4 was fused to ScCDA1 to construct AtCBM4-ScCDA1, which was subsequently expressed in E. coli. Assessment of its catalytic properties revealed that the fusion protein shared the same optimal conditions as ScCDA1. Under optimal conditions, AtCBM4-ScCDA1 exhibited an activity of approximately 265.33 U/mg, compared to 238.94 U/mg for ScCDA1. This enhanced activity is presumed to result from the structural stabilization provided by the CBM fusion, which facilitates substrate interaction.
When both enzymes were reacted with highly substituted CA (DS 2.5 and 3.0) for 48 h, FT-IR analysis revealed an increased distribution of hydroxyl groups, indicating deacetylation. Consistently, ¹³C-NMR analysis showed that the characteristic C=O and CH₃ peaks corresponding to acetyl groups were reduced in the enzyme-treated samples compared with the untreated control, with a more pronounced reduction observed for the AtCBM4-ScCDA1 treatment. These findings demonstrate that the incorporation of AtCBM4 enhances enzyme accessibility to CA and effectively improves deacetylation efficiency.

목차 (Table of Contents)

• ⅠⅠ. 서 론 1
• Ⅱ. 연구사 4
• 1. 셀룰로오스 아세테이트의 생분해 메커니즘 4
• 2. 특정 미생물 및 효소에 의한 CA의 분해 5
• 3. 복잡한 환경에서의 CA 분해 평가 5
• Ⅲ. 효모 유래 키틴 탈아세틸화 효소의 원핵생물 발현 시스템 구축 7
• 1. 서론 7
• 2. 재료 및 방법 8
• 2. 1. 공시재료 8
• 2. 2. ScCDA1의 대장균 기반 발현 시스템 설계 8
• 2. 2. 1. ScCDA1 유전자 증폭 8
• 2. 2. 2. ScCDA1의 발현 벡터 내 도입 9
• 2. 2. 3. 형질전환 9
• 2. 2. 4. 서열 검증 9
• 2. 3. 재조합 ScCDA1의 발현 및 정제 12
• 2. 3. 1. 종균 및 본 배양 12
• 2. 3. 2. 단백질 발현 유도 12
• 2. 3. 3. 세포 파쇄 및 가용성 단백질의 회수 12
• 2. 3. 4. 친화 크로마토그래피 14
• 2. 3. 5. 탈염 및 완충액 교환 14
• 2. 3. 6. 정제 효율 평가 14
• 2. 4. ScCDA1의 최적 조건 규명 15
• 2. 4. 1. 온도 및 pH에 따른 효소 활성 15
• 2. 4. 2. 활성 촉진 인자 분석 15
• 2. 4. 3. 화학 첨가제를 이용한 구조적 안정성 평가 16
• 3. 결과 및 고찰 17
• 3. 1. 재조합 단백질의 발현 17
• 3. 1. 1. 융합 태그 유무에 따른 발현량 비교 17
• 3. 1. 2. 발현 유도 물질의 농도 최적화 19
• 3. 1. 3. 재조합 단백질의 정제 21
• 3. 2. ScCDA1의 최적 조건 규명 23
• 3. 2. 1. 온도 및 pH 조건의 최적화 23
• 3. 2. 2. 금속 이온에 의한 활성 촉진 평가 25
• 3. 2. 3. 재조합 단백질의 구조적 안정성 평가 27
• 4. 결론 29
• Ⅳ. 키틴 탈아세틸화 효소와 셀룰로오스 결합 모듈 간의 융합 단백질 제작 및 셀룰로오스 아세테이트의 생물학적 탈아세틸화 평가 31
• 1. 서론 31
• 2. 재료 및 방법 33
• 2. 1. 공시재료 33
• 2. 2. 계산생물학 기반 셀룰로오스 결합 모듈의 선정 33
• 2. 3. 융합 단백질의 대장균 기반 발현 시스템 설계 33
• 2. 3. 1. AtCBM4-ScCDA1 단편 제작 37
• 2. 3. 2. 융합 단백질 서열의 발현 벡터 내 도입 37
• 2. 3. 3. 형질전환 37
• 2. 3. 4. 서열 검증 38
• 2. 4. 융합 단백질의 발현 및 정제 38
• 2. 4. 1. 종균 및 본 배양 38
• 2. 4. 2. 세포 파쇄 및 가용성 단백질 회수 38
• 2. 4. 3. 친화 크로마토그래피 39
• 2. 4. 4. 탈염 및 완충액 교환 39
• 2. 4. 5. 정제 효율 평가 39
• 2. 5. 융합 단백질의 최적 조건 규명 39
• 2. 5. 1. 온도 및 pH 조건의 최적화 40
• 2. 5. 2. 금속 이온에 의한 활성 촉진 분석 40
• 2. 5. 3. 구조 안정성 평가 40
• 2. 6. 셀룰로오스 아세테이트의 탈아세틸화율 평가 40
• 2. 6. 1. FT-IR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) 분석 41
• 2. 6. 2. 13C-NMR (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance) 분석 41
• 3. 결과 및 고찰 42
• 3. 1. 셀룰로오스 결합 모듈의 선정 42
• 3. 2. 융합 단백질의 발현 및 정제 43
• 3. 2. 1. 융합 태그를 이용한 융합 단백질의 발현 43
• 3. 2. 2. IPTG 농도에 따른 융합 단백질의 발현율 분석 45
• 3. 2. 3. 융합 단백질의 정제 46
• 3. 3. 융합 단백질의 최적 조건 규명 48
• 3. 3. 1. AtCBM4 융합에 따른 온도 및 pH 영향 평가 48
• 3. 3. 2. AtCBM4 융합에 따른 금속 이온 활성화 50
• 3. 3. 3. 융합 단백질의 구조 안정성 평가 50
• 3. 3. 4. ScCDA1 및 AtCBM4-ScCDA1의 최적 활성 53
• 3. 4. DS별 셀룰로오스 아세테이트의 탈아세틸화율 평가 54
• 3. 4. 1. FT-IR 분석 54
• 3. 4. 2. 13C-NMR 분석 54
• 4. 결론 58
• Ⅵ. 결론 60
• 참고문헌 62
• Abstract 73