변형된 Particle Bombardment 기술을 활용한 옥수수 엘리트 계통들의 형질전환 효율 증진 연구 = Modified Particle Bombardment Technique for Enhanced Genetic Transformation in Elite Maize lines

국문 초록 (Abstract)

옥수수(Zea mays L.)는 세계 3대 작물로 식량, 사료 및 산업적 원료로 활용되며. 세포 내로 외래 유전자를 도입하는 형질전환을 통해 수량, 스트레스 내성, 영양가 등을 향상시킬 수 있다. 그러나 복잡한 게놈 구조와 유전자형에 의존적인 형질전환 효율로 인해 옥수수의 안정적인 형질전환이 여전히 까다롭다. 이러한 제약을 극복하기 위해 Agrobacterium 매개 형질전환보다 유전자형의 제약이 적은 입자총격법(Particle Bombardment)이 널리 이용되고 있다. Agrobacterium 매개 형질전환 방법은 토양미생물이 숙주식물의 세포 내로 DNA를 전달하는 특성을 이용한 방식으로 안정적인 형질전환이 가능하지만, 옥수수 엘리트 자식계통에 적용하기 어렵다는 문제가 있다. 앞서 말한 Agrobacterium 매개 형질전환 방식과 다르게, Particle Bombardment는 DNA를 강한 압력을 통해 세포에 전달하는 방식으로 유전자형의 제약이 거의 없다. 다만, 세포 내에 DNA가 삽입될 수 있을 정도로 강한 압력을 가하기 때문에 세포 손상의 문제가 있으며 유전자가 일정하게 삽입되지 않아 유전자 발현의 안정성 면에서 문제가 발생한다. 따라서 Particle Bombardment 방식을 선택하였을 때 해당 문제를 개선하는 방향으로 프로토콜을 수립하는 것이 중요하다. HW3와 05S8027은 한국에서 개발한 엘리트 자식계통(inbred line)이지만, HW3는 찰옥수수(waxy)이며 05S8027은 종실용 옥수수(dent)이다. 두 계통은 성분 구성과 유전적 적합성 및 형질전환·재분화 능력이 다르기 때문에 계통별 최적화 프로토콜이 필요하다.
본 연구에서는 먼저 수분 후 11일(DAP, day after pollination)이 지난 약 1.5-2mm 크기의 HW3 미성숙 배아(immature embryo)를 재료로 사용하였다. 3일의 pre-culture 후, 배아에 RCD1 유전자를 도입하였고, 조직 회복을 위해 2주간 resting 배지에서 배양하였다. RCD1 유전자는 비생물학적 스트레스 저항성에 핵심 역할을 하는 조절 유전자이다. HW3와 05S8027 모두 정상적으로 캘러스가 유도되었으며, 이후 phosphinothricin(PPT)이 포함된 두 단계의 선발 배지에서 배양하면서 갈변한 callus를 제거하였다. 세포 분열과 신초 유도를 위해 cytokinin 계열의 호르몬인 zeatin이 포함된 신초 형성 배지에서 16:8의 명암주기로 배양하였다. 신초의 길이가 5 cm가 되었을 때 토양으로 옮겨주는 순화 과정을 진행하였다.
재분화 효율은 waxy 계통인 HW3에서 7.63-17.15%, dent 계통인 05S8027에서 6.40-14.22% 범위였다. HW3와 05S8027은 각기 다른 형태의 캘러스를 형성하여 형태적 차이를 관찰할 수 있었다. bar(blpR) PCR test를 통해 양성 개체를 형질전환체로 간주하였고, 형질전환 효율은 HW3은 0.71-0.97%, 05S8027은 0.91-3.32%로 두 계통은 동일한 프로토콜을 사용하였음에도 불구하고 pB7FWG2-RCD1 (Sus-1)와 pB7FWG2-RCD1 (Tol-1)#2를 사용한 처리구에서 월등히 높은 형질전환 효율을 확인할 수 있었다.
본 연구에서 확립한 프로토콜은 기존의 16-21주 소요 프로토콜보다 30-40% 단축된 주기로, 70일만에 형질전환 옥수수를 제작할 수 있었다. 해당 프로토콜을 적용함으로써 waxy 계통을 비롯한 dent 계통 모두 재분화와 형질전환이 가능한 체계를 구축함으로써 옥수수 형질전환 연구에 효율적으로 적용될 수 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Maize(Zea mays L.) is one of the world’s three major crops and is widely utilized as a source of food, feed, and industrial raw materials. Genetic transformation enables the improvement of yield, stress tolerance, and nutritional quality; however, stable transformation in maize remains difficult due to its complex genome structure and strong genotype dependency. To overcome these limitations, particle bombardment, which is less restricted by genotype than Agrobacterium-mediated transformation, has been widely used. Although Agrobacterium-mediated transformation allows stable gene integration by exploiting the natural DNA transfer ability of soil bacteria, its application to elite maize inbred lines is limited. In contrast, particle bombardment introduces DNA into plant cells using high pressure with minimal genotype dependency, but it often causes cellular damage and irregular gene integration, resulting in instability of transgene expression. Therefore, it is essential to establish an optimized protocol that alleviates these drawbacks.
HW3 and 05S8027 are elite maize inbred lines developed in Korea; HW3 is a waxy type, whereas 05S8027 is a dent type. Because these two lines differ in biochemical composition, genetic background, and regeneration and transformation capacities, genotype-specific optimization is required.
In this study, immature embryos (1.5–2.0 mm) harvested at 11 days after pollination (DAP) from the HW3 line were used as explants. After 3 days of pre-culture, the embryos were bombarded with the RCD1 gene and subsequently cultured on resting medium for 2 weeks to allow tissue recovery. The RCD1 gene is a key regulatory gene involved in abiotic stress tolerance. Callus formation was successfully induced in both HW3 and 05S8027, and browned calli were removed during two rounds of selection on phosphinothricin(PPT)-containing media. For shoot induction, calli were cultured on shooting medium supplemented with the cytokinin zeatin under a 16:8 h light/dark photoperiod, and regenerated shoots were acclimatized to soil when they reached approximately 5 cm in height.
The regeneration efficiency ranged from 7.63–17.15% in the waxy line HW3 and from 6.40–14.22% in the dent line 05S8027. The two lines formed distinct types of calli, showing clear morphological differences. Plants positive in the bar(blpR) PCR test were regarded as transgenic, and the transformation efficiencies were 0.71–0.97% in HW3 and 0.91–3.32% in 05S8027; notably higher transformation efficiencies were obtained in the treatments using pB7FWG2-RCD1 (Sus-1) and pB7FWG2-RCD1 (Tol-1)#2 despite the use of the same protocol.
The protocol established in this study reduced the total transformation period to approximately 70 days, which is 30–40% shorter than conventional protocols requiring 16–21 weeks. This optimized system enables efficient regeneration and transformation of both waxy and dent maize inbred lines and can be effectively applied to maize genetic transformation research.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• 1. 옥수수의 특성 1
• 2. 옥수수 생산 및 수급 현황 2
• 3. 식물 형질전환 기술 3
• 4. 옥수수 식물 형질전환 기술 현황 4
• 5. 옥수수 형질전환 기술 향상의 필요성 5
• 6. 연구 목표 6
• Ⅱ. 재료 및 방법 8
• 1. 식물 재료 확보 8
• 2. 찰옥수수(waxy)와 일반 종실용 옥수수(dent)의 차이점 8
• 3. 미성숙 배아 채취 9
• 4. 벡터 카세트(vector cassette) 제작 9
• 5. Particle Bombardment process 10
• 1) Embryo Pre-culture(EPC) 10
• 2) Bombardment Osmotic Treatment(BOT) 10
• 3) Particle Bombardment 11
• 4) Resting 13
• 5) Selection I 13
• 6) Selection II 13
• 7) Shooting 13
• 8) Rooting 14
• 9) 순화(Acclimatization) 14
• 6. 식물 형질전환체 선발 14
• 7. 형질전환 식물체 종자 수확 15
• Ⅲ. 결과 17
• 1. 계통별 재분화 및 형질전환 단계별 특성 17
• 1) 미성숙 배아 전처리 및 캘러스 유도 17
• 2) 찰옥수수(waxy) 계통 HW3의 형질전환 17
• 3) 종실용 옥수수(dent) 계통 05S8027의 형질전환 21
• 2. 계통별 재분화 효율 25
• 3 계통별 형질전환 효율 27
• Ⅳ. 적요 31
• 참고문헌 34
• Abstract 39