과불화옥탄술폰산의 혈소판 매개 혈액응고 활성 촉진 = Perfluorooctanesulfonic acid activates coagulation pathway through oxidative stress-mediated phosphatidylserine exposure in platelets.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Perfluorooctanesulfonic acid (PFOS) is a persistent organic pollutant widely detected in the environment and recently identified as a potential risk factor for cardiovascular disease. However, the specific toxicological mechanisms by which PFOS affects platelets—key mediators of thrombosis—remain unclear. This study aimed to investigate whether PFOS induces phosphatidylserine (PS) exposure and subsequent procoagulant activity, specifically focusing on the roles of mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Our results demonstrated that PFOS treatment induced a significant, concentration-dependent increase in PS exposure on the platelet membrane. This disruption of membrane asymmetry was driven by the activation of scramblase and inhibition of flippase. Mechanistically, PFOS elevated intracellular calcium levels, depleted ATP, and caused the collapse of mitochondrial membrane potential. Concurrently, excessive generation of reactive oxygen species (ROS) and depletion of glutathione (GSH) confirmed that platelets were subjected to severe oxidative stress. Notably, pretreatment with antioxidants (NAC, Catalase) or a calcium chelator (BAPTA-AM) effectively attenuated PFOS-induced PS exposure and thrombin generation. In conclusion, PFOS promotes coagulation activity through a mechanism involving mitochondrial dysfunction and oxidative stress, which leads to calcium- dependent PS exposure. These findings suggest a potential toxicological mechanism linking PFOS exposure to thrombotic risks associated with cardiovascular disease. □ keywords Platelets, Perfluorooctanesulfonic acid (PFOS), Phosphatidylserine (PS) exposure, oxidative stress, mitochondria, coagulation activity, cardiovascular disease

국문 초록 (Abstract)

과불화옥탄술폰산 (Perfluorooctanesulfonic acid, PFOS)은 환경 내 높은 잔류성과 생물 농축성을 지닌 유기오염물질로써, 최근 역학연구에서 심혈관계 질환의 잠재적 위험인자로 지목되고 있다. 그러나 심혈관 질환의 주요 병인인 혈전 형성 기전과 관련하여, PFOS가 혈소판의 혈액응고 활성에 미치는 구체적인 독성학적 영향은 명확히 규명되지 않았다. 이에 본 연구는 실제 혈소판을 이용하여 PFOS 노출이 포스파티딜세린(Phosphatidylserine,PS)의 막 외부 노출을 유도하여 실제 혈액응고를 촉진하는지 확인하고, 그 분자적 기전으로서 미토콘드리아 기능 손상 및 산화적 스트레스의 역할을 확인하고자 하였다. 그 결과, PFOS를 처리한 혈소판에서는 농도에 비례하여 막 표면의 PS노출이 유의하게 증가하는 현상이 관찰되었다. 이러한 막 인지질 비대칭성의 붕괴는 인지질 재배치 효소인 Scramblase가 활성화되고 반대로 Flippase의 활성은 억제되었기 때문인 것으로 확인되었다. 세포 내부 기전을 살펴보면, PFOS는 세포내 칼슘(Ca2+)농도를 높이고 에너지원인 ATP를 고갈시켰으며, 미토콘드리아 막 전위의 붕괴를 유발하였다. 이 과정에서 활성산소종(ROS)생성이 촉진되고 항산화 물질인 Glutathione(GSH)이 감소하여, 혈소판이 심각한 산화적 스트레스 상태에 놓였음이 확인되었다. 특히, 외인성 항산화제 (NAC, Catalase)와 칼슘 킬레이터(BAPTA-AM)의 전처리는 PFOS에 의해 발생한 PS 노출, 막 전위 붕괴와 Thrombin 생성을 효과적으로 억제하였다. 결과적으로, PFOS가 혈소판 내 미토콘드리아 기능 손상을 통해 과도한 ROS 생성을 유도하여 칼슘 의존적인 막 인지질 비대칭성을 붕괴 시켜 결국 산화적 스트레스로 인해 PS가 노출되었고 Thrombin 생성이 증가하였다. 최종적으로 PFOS 노출은 혈액응고 활성을 촉진시켰으며 PFOS 노출이 혈소판 매개 심혈관계질환에 영향을 미칠 수 있음을 알 수 있었다.

목차 (Table of Contents)

• List of Figures
• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 실험방법 5
• 1. 시약 및 Antibody 5
• 2. Washed platelets 제조 5
• 3. 혈소판의 Phosphatidylserine 노출 측정 6
• 4. 혈소판 내 ROS 측정 6
• 5. 혈소판 내 Intracellular glutathione 측정 6
• 6. 혈소판 내 Ca2+ level 측정 6
• 7. 혈소판 내 ATP 측정 6
• 8. 혈소판 내 Mitochondria membrane potential 측정 7
• 9. 혈소판의 Phospholipid transporters 측정 7
• 10. Prothrombinase assay를 이용한 혈액 응고 활성의 측정 7
• 11. 통계처리 7
• Ⅲ. 실험결과 9
• Ⅳ. 고찰 16
• Ⅴ. 참고문헌 18
• Ⅵ. Abstract 24