Regulator of calcineurin 1 (RCAN1)에 의한 Mixed lineage kinase domain-like pseudokinase (MLKL) 활성 조절 기전 연구 = Regulator of calcineurin 1 (RCAN1)-mediated regulation of Mixed lineage kinase domain-like pseudokinase (MLKL) activation

국문 초록 (Abstract)

Necroptosis는 caspase 활성이 차단된 조건에서 RIPK1–RIPK3–MLKL 축이 활성화되며, 최종적으로 MLKL oligomerization을 통해 세포막 파괴와 염증성 분자 방출을 유도하는 caspase 비의존적 세포 사멸 경로이다. 이러한 경로는 강한 염증 반응을 유발한다는 특징 때문에 다양한 병리적 상황에서 과도하게 활성화되지만, 이를 미세하게 조절하는 내인성 인자들은 아직 충분히 밝혀지지 않았다.
Regulator of calcineurin 1(RCAN1)은 calcineurin의 내인성 억제 단백질로, 스트레스 조건에서 발현이 변화하며 여러 세포 신호 조절 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. Calcineurin은 Ca2+/calmodulin 의존적 탈인산화 효소로 NFAT 전사인자 활성 조절, 염증 반응, 스트레스 적응 등 다양한 생리적 과정에 관여한다. 이러한 RCAN1–calcineurin 축이 세포 생존 및 사멸 신호에도 영향을 미칠 가능성이 제기되어 왔으나, Necroptosis에서의 역할은 규명된 바 없었다.
본 연구는 RCAN1이 necroptosis의 조절 인자로 기능할 수 있다는 선행 관찰(RCAN1–RIPK1 상호작용)을 기반으로, RCAN1이 RIPK1 의존적 necroptosis 신호전달에 어떤 영향을 미치는지 체계적으로 분석하고자 수행되었다.
RCAN1 유전자형이 서로 다른 MEF에서 necroptosis를 유도한 결과, Rcan1-/- MEF 세포에서는 p-RIPK1, p-RIPK3, p-MLKL의 인산화 및 MLKL oligomerization이 증가하며 과도한 세포 사멸이 나타난 반면, RCAN1-transgenic MEF 세포에서는 동일 자극에서 신호 활성과 세포 사멸 감수성이 감소하였다. 또한 calcineurin 억제제 전처리 시 p-RIPK1, p-RIPK3, p-MLKL이 증가하여 RCAN1 결손에서 관찰된 신호 활성 증가와 일관된 변화를 보였으며, 이를 통해 RCAN1의 necroptosis 조절 기능이 calcineurin 신호와 연계되어 있음을 확인하였다.
이러한 결과는 RCAN1이 RIPK1-RIPK3-MLKL 신호축을 억제하는 내인성 조절 인자로 기능하며, RCAN1-calcineurin 축이 necroptosis의 조절에 관여하는 핵심 신호축임을 시사한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Necroptosis is a caspase-independent cell death pathway in which the RIPK1–RIPK3–MLKL axis becomes activated under conditions of caspase inhibition, ultimately leading to MLKL oligomerization, plasma membrane rupture, and the release of inflammatory molecules. This pathway contributes to excessive inflammation in various pathological contexts, the endogenous regulators that finely regulate necroptotic signaling remain incompletely defined.
Regulator of calcineurin 1 (RCAN1) is an endogenous inhibitor of calcineurin whose expression is dynamically regulated under stress conditions, and it is known to participate in multiple signaling processes. Calcineurin is a Ca2⁺/calmodulin-dependent phosphatase involved in diverse physiological responses, including NFAT activation, inflammatory signaling, and stress adaptation. Although the RCAN1–calcineurin axis has been suggested to influence cell survival and death pathways, its role in necroptosis has not been elucidated.
This study was conducted to systematically examine whether RCAN1 functions as a regulatory factor in necroptosis, based on our prior laboratory observation of a potential RCAN1–RIPK1 interaction that may modulate RIPK1-dependent necroptotic signaling.
When necroptosis was induced in MEFs with different RCAN1 genotypes, Rcan1-/- cells exhibited increased phosphorylation of RIPK1, RIPK3, and MLKL, as well as enhanced MLKL oligomerization, resulting in exaggerated necroptotic cell death. In contrast, RCAN1-transgenic cells showed reduced signaling activation and lower sensitivity to necroptosis under the same stimulation. Furthermore, pretreatment with calcineurin inhibitors partially reproduced the hyperactivation observed in RCAN1-deficient cells, suggesting that the necroptosis-regulating function of RCAN1 may be linked to calcineurin signaling.
These findings indicate that RCAN1 acts as an endogenous suppressor of the RIPK1–RIPK3–MLKL pathway and that the RCAN1–calcineurin axis contributes to the regulation of necroptosis.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서 론 1
• Ⅱ. 실 험 방 법 4
• 1. 재료 및 발현 벡터 4
• 2. Stable MEF cell line 제작 4
• 3. LDH assay 5
• 4. Propidium Iodide assay 6
• 5. Western Blot analysis 6
• 6. MLKL oligomerization analysis 6
• 7. 세포배양 및 형질 주입 7
• Ⅲ. 결 과 8
• 1. RCAN1 WT, KO, Tg 마우스 배아로부터 분리한 MEF는 약 20회 계대 배양 후 자연적으로 immortalization 되었다. 8
• 2. RCAN1 결손은 TNF-α에 의해 유도되는 세포 사멸을 증가시키며, RCAN1 과발현은 세포 사멸을 억제한다. 11
• 3. RCAN1 결손은 TNF-α/Z-VAD 처리에 의해 유도되는 RIPK1-RIPK3-MLKL 신호전달의 활성화를 촉진한다. 14
• 4. RCAN1 결손 MEF에서 유도되는 necroptosis는 RIPK1 의존적 신호전달에 의해 매개된다 17
• 5. RCAN1 결손은 necroptosis 신호를 과활성화하고, RCAN1 과발현은 해당 신호를 억제한다 20
• 6. RCAN1 결손은 MLKL oligomerization을 강화하고, RCAN1 과발현은 해당 신호를 억제한다 23
• 7. Calcineurin 억제는 WT MEF에서 TNF-α/Z-VAD 유도성 necroptosis 신호를 변화시킨다. 26
• 8. Calcineurin 활성 변화는 necroptosis downstream 신호전달을 양방향으로 조절한다 29
• Ⅳ. 논 의 32
• Ⅴ. 참 고 문 헌 36
• Ⅵ. Abstract 39