RAW264.7 세포에서 무지개송어 비장 추출물의 항염증 기전 분석 및 활성 성분 규명 = Analysis of the Anti-Inflammatory Mechanism and Identification of Active Compounds of Rainbow Trout Spleen Extract in RAW264.7 Cells

국문 초록 (Abstract)

천연물은 새로운 의약품 개발의 중요한 자원으로 이를 활용한 항염증제 개발에 대한 연구는 과거부터 꾸준히 진행되어왔다. 하지만 어류 추출물의 항염증 잠재력은 아직 자세히 연구되지 않았다. 본 연구에서는 쥐의 대식세포인 RAW264.7 세포를 대상으로 무지개송어 비장 추출물의 항염증 조절 기전을 분석하고 효과 성분을 규명하는 것을 목적으로 하였다. RAW264.7 세포를 대상으로 무지개송어 비장 추출물 처리 시 LPS로부터 유도되는 Nitric Oxide 생성을 농도 의존적으로 억제하는 항염증 효과를 확인하였다. 또한 비장 추출물은 LPS 처리로부터 유도되는 iNOS와 COX-2를 mRNA와 단백질 수준에서 모두 억제하였다. 이후 비장 추출물에서 항염증 효과 성분을 찾기 위해 용매 분획법을 이용한 분획화를 진행하였고 UHPLC-MS/MS를 이용한 주성분 분석을 진행하였다. 용매의 극성에 따라 비장 crude extract를 총 4가지 분획물로 분획하였고 그중 n-BuOH 분획에서 세포 독성 없이 안정적인 항염증 효과를 확인하였다. OSB는 비장 crude extract 보다 강한 항염증 효과를 보였으며 처리 시간, 농도 조건에 따라 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하는 항염증 효과를 확인하였다. RAW264.7 cells에서 LPS 자극으로 인해 활성화되는 신호 전달 경로인 NF-κB 신호 전달 경로에서 OSB의 항염증 효과 조절 기전을 분석하였다. OSB의 처리는 NF-κB 신호 전달 경로에서 IκBα의 phosphorylation에 이은 degradation을 억제하였고 이로 인해 p65의 세포질에서 핵으로의 이동을 차단하는 항염증 효과를 보였다. OSB의 처리는 LPS 자극으로 유도되는 NF-κB 신호 전달 경로의 활성화를 억제하여 LPS 자극으로 유도되는 pro-inflammatory cytokine의 mRNA 전사 활성을 억제하였고 M1 대식세포 표면 마커인 CD86의 발현을 억제하였으며 세포 내 ROS 생성을 억제하였다. 추가적인 분획 과정을 거쳐 OSB로 부터 하위 분획물인 B-THP와 B-TT를 얻었다. TCA와 TUDCA를 주성분으로 포함하는 B-TT의 처리 효과는 B-THP 처리와 구분되는 강한 항염증 활성을 나타냈기 때문에 OSB의 항염증 효과에 대한 주요 활성 성분을 TCA, TUDCA로 추정하였다. 본 연구를 통해 무지개송어 비장 추출물의 분획물 중 n-BuOH 분획인 OSB의 항염증 조절 기전을 일부 규명하였고, 비장 추출물의 항염증 효과에 대한 주요 성분이 TCA와 TUDCA임을 규명하였다. 따라서 본 연구는 천연물 원료로써 무지개송어 비장의 염증 치료제 개발에 대한 잠재력을 보여준다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• 1. 염증 반응 1
• 2. NF-κB를 통한 염증 반응 유도 기전 4
• 3. 염증 반응에서 대식세포의 기능 7
• 4. 기존 항염증제의 치료 표적과 기능적 한계 10
• 5. 천연물 유래 항염증제 개발 14
• 6. 담즙산 대사 및 담즙산의 항염증 효과 17
• 7. 어류 부산물의 항염증 소재로서의 연구 가치 19
• Ⅱ. 재료 및 방법 20
• 1. 추출물 및 분획물 준비 20
• 2. 세포 배양 20
• 3. Nitric oxide assay 21
• 4. MTT assay 21
• 5. qRT-PCR 21
• 6. Western blot 22
• 7. UHPLC-MS/MS 및 MPLC 23
• 8. 세포질 및 핵 분획 24
• 9. Immunofluorescence 24
• 10. Reactive Oxygen Species 분석 25
• 11. Statistical analysis 25
• Ⅲ. 결과 26
• 1. 무지개송어 추출물의 항염증 효과 분석 26
• 2. 무지개송어 비장 crude extract의 항염증 효과 28
• 3. 무지개송어 비장 crude extract 분획화 및 성분 분석 30
• 4. 무지개송어 비장 crude extract 분획물의 항염증 효과 32
• 5. OSB의 iNOS와 COX-2 발현 억제 34
• 6. OSB의 NF-B 신호 전달 경로 억제 36
• 7. OSB의 대식세포 M1 polarization 억제 38
• 8. OSB의 항염증 효과 성분 추적 40
• 9. B-TT의 NF-B 신호 전달 경로 억제 42
• 10. B-TT의 대식세포 M1 polarization 억제 44
• 11. TCA와 TUDCA의 항염증 효과 47
• 12. TCA와 TUDCA의 시너지 효과에 의한 NF-B 신호 전달 경로 억제 49
• 13. TCA와 TUDCA의 시너지 효과 의한 대식세포 M1 polarization 억제 51
• Ⅳ. 결론 및 논의 53
• Ⅴ. 참고문헌 66
• Ⅵ. 영문초록 80