박테리아 RecN의 구조 연구를 위한 정제 및 특성 분석 : DNA 복구에 관여하는 RecN의 정제 및 상호작용 분석 = Purification and characterization of bacterial RecN for structural studies

국문 초록 (Abstract)

RecN은 구조 유지 염색체 단백질(SMC, Structural Maintenance of Chromosomes) 유사 단백질로서, 박테리아의 DNA 이중 가닥 절단(DSB, double-strand break) 수복 및 상동재조합 경로에서 필수적인 역할을 수 행한다. RecN은 RecA 단백질과 함께 작용하여 DNA 손상을 인식하고 가닥 침입을 촉진하는 것으로 알려져 있으나, 그 분자 메커니즘과 구조 -기능 관계는 여전히 명확히 규명되지 않았다. 그러나 RecN의 coiled-coil 구조는 고도의 유동성을 나타내어 구조생물학적 분석이 매 우 어렵다. 따라서 본 연구는 대장균에서 RecN의 최적화된 발현, 정제, 및 cryo-EM 구조 분석을 수행하였다. Rosetta(DE3)를 2×TY 배지에서 0.1 mM IPTG, 22°C로 유도한 결과 최적의 발현 및 용해도를 얻었으 며, 3리터 배양으로 24 mg 이상의 RecN을 획득하였다. Strep-tag 정제 는 His-tag보다 우수한 순도와 회수율을 제공하였다. 표준 염(150 mM NaCl)에서는 RecN이 침전되었으나, 고염(1 M NaCl)에서 극적인 용해도 향상이 관찰되었다. Benzonase 처리 실험을 통해 이 염 의존성이 DNA- 단백질 상호작용이 아닌 RecN의 coiled-coil 구조 자체의 생물물리학적 특성임을 입증하였다. 크기 배제 크로마토그래피 분석에서 RecN은 약 140-150 kDa의 이합체로 주로 존재하였으며, 소량의 단량체 및 다양한 구조체가 관찰되었다. LC-MS/MS 분석에서는 GroEL과 PpiD 같은 샤페 론이 검출되어 올리고머화 과정의 일시적 상호작용을 시사한다. Cryo-EM 분석에서 고품질 이미지와 명확한 2D 클래스 평균이 얻어져 RecN의 elongated coiled-coil 구조와 2중 대칭성이 시각화되었다. 그러 나 RecN의 고도의 구조적 유동성과 이질성으로 인해 3D 재구성에 실 패하였다. ATPγS 결합이 부분적으로 안정화하였으나 충분하지 않았다. 본 연구는 RecN의 고수율 정제 프로토콜을 확립하고, 염 의존적 용해 도와 이합체 특성을 규명하였다. 고해상도 구조 결정을 위해서는 RecA-DNA 필라멘트와의 삼원 복합체 형성을 통한 구조 안정화가 필수 적이다. 단분자 이미징과 cryo-EM의 통합 접근으로 RecN의 DNA 손상 인식 메커니즘을 고해상도에서 규명할 수 있을 것으로 기대된다. 핵심 단어: RecN, DNA 손상 수복, SMC 유사 단백질, 단백질 정제, Strep-tag, 염 의존적 용해도, coiled-coil, 구조적 이질성, 저온전자현미 경, 단분자 형광 현미경

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

RecN is an SMC-like protein essential for bacterial DNA repair and homologous recombination. Although RecN recognizes DNA damage with RecA, its molecular mechanism remains unclear due to high structural flexibility of its coiled-coil architecture. This study optimized RecN expression, purification, and cryo-EM analysis in E. coli. Rosetta(DE3) induction in 2×TY medium with 0.1 mM IPTG at 22°C yielded 24 mg RecN from 3-liter culture. Strep-tag purification provided superior purity compared to His-tag. RecN showed poor solubility at standard salt (150 mM NaCl) but dramatic enhancement at high salt (1 M NaCl). Benzonase treatment confirmed salt-dependence reflects RecN's coiled-coil biophysics, not DNA interactions. Size-exclusion chromatography revealed RecN exists primarily as a dimer (~140–150 kDa). LC-MS/MS detected chaperones GroEL and PpiD during oligomerization. Cryo-EM yielded high-quality 2D class averages visualizing RecN's elongated structure and two-fold symmetry. However, structural flexibility prevented 3D reconstruction; ATPγS binding provided only partial stabilization. This study established optimized RecN purification protocols and characterized its salt-dependent solubility and dimeric nature. RecN–RecA–DNA ternary complex formation is essential for high-resolution structure determination. Integration of single-molecule fluorescence microscopy and cryo-EM will enable comprehensive characterization of RecN's DNA recognition mechanism.
Keywords: RecN, DNA repair, SMC-like protein, protein purification, Strep-tag, salt-dependent solubility, coiled-coil, structural heterogeneity, cryo-EM.

목차 (Table of Contents)

• 국문 초록 1
• Contents 3
• LIST OF TABLES 6
• LIST OF FIGURES 7
• Ⅰ. INTRODUCTION 9
• 1.1. Role of RecA in Homologous Recombination 9
• 1.2. RecN as an SMC-like Protein in DSB Repair 10
• 1.3. Relevance for Structural Studies 12
• 1.4. Rationale and Objectives of This Study 14
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 18
• 2.1. Strains, Plasmids, and Growth Conditions 18
• 2.2. Recombinant Expression of RecN 22
• 2.3. Affinity Purification (His-tag and Strep-tag) 22
• 2.4. SDS-PAGE Analysis 23
• 2.5. Size-Exclusion Chromatography (SEC) Characterization 23
• 2.6. Cryo-EM Sample Preparation and Data Collection 24
• 2.6.1. Cryo-EM Sample Preparation 24
• 2.6.2. Grid Vitrification Conditions 25
• 2.6.3. Cryo-EM Data Collection Parameters 25
• 2.6.4. Image Processing Workflow 26
• 2.6.5 Apo and ATPγS Sample Preparation Details 26
• 2.6.6 Data Processing and Preliminary Analysis 27
• Ⅲ. RESULTS 28
• 3.1. Cloning Verification of RecN 28
• 3.1.1. Host Strain Screening in LB Medium 28
• 3.1.2. Medium Optimization Using 2×TY for Enhanced RecN
• Yield 32
• 3.1.3. IPTG Concentration and Temperature Optimization in
• 2×TY Medium 35
• 3.2. Comparison of His-Tag and Strep-Tag Purification 36
• 3.3. Buffer Optimization for Enhanced RecN Recovery 40
• 3.4. Evaluating benzonase treatment to improve RecN recovery
• under low-salt conditions 43
• 3.5. Summary of Expression and Purification Optimization 48
• 3.6. Large-Scale Purification and Yield Optimization 50
• 3.7. Size-Exclusion Chromatography Analysis Reveals Oligomeric
• State and Conformational Heterogeneity 52
• 3.8. Cryo-EM Data Collection and Preliminary Image Analysis 56
• Ⅳ. DISCUSSION 64
• 4.1. RecN’s Salt-Dependent Solubility and Biophysical Properties
• 64
• 4.2. RecN Oligomerization and Conformational Heterogeneity 65
• 4.3. Cryo-EM Technical Achievements and Challenges 66
• 4.4. Prospective Approaches for RecN Structural Stabilization and
• Functional Studies 67
• 4.4.1. RecN–DNA Complex Formation 67
• 4.4.2. RecN–RecA–DNA Ternary Complex 68
• Ⅴ. CONCLUSION 69
• Ⅵ. REFERENCES 70
• Ⅶ. ABSTRACTS 72
• Ⅸ. ACKNOWLEDGEMENTS 74