그람양성균의 신속·비표지 검출을 위한 전기화학 기반의 바이오센서 제작 연구 = Studies on electrochemical biosensors for rapid and label-free detection of Gram-positive bacteria

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Bacterial infections in environmental and clinical settings remain one of the major causes of mortality, and Gram-positive bacteria contribute significantly to the increase in healthcare costs and fatality rates by causing diseases such as sepsis and food poisoning. Conventional culture-based diagnostic methods require long analysis times, while molecular diagnostic techniques are limited by the need for expensive instrumentation and skilled personnel. In this study, electrochemical biosensors utilizing multichannel electrode architectures were developed to achieve rapid and label-free detection of Gram-positive bacteria. Two distinct sensing strategies were designed: a peptide-based biosensor (16-GDEs) and an antibody-based biosensor (16-AuIWEs). In the peptide-based biosensor, complementary peptide pairs were immobilized on 16-channel gold disk electrodes (16-GDEs) incorporating a conductive AuNPs@Ti3C2Tz nanocomposite to enhance sensitivity and selectivity. Differential pulse voltammetry (DPV) analysis of Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, and Micrococcus luteus demonstrated strong linear correlations (Adj. R2 ≥ 0.93) between bacterial concentrations and peak currents, achieving detection limit (LOD) of 5 × 102 CFU·mL-1. In the antibody-based biosensor, 16-channel gold interdigitated wave-shaped electrodes (16-AuIWEs) with finger intervals 10 μm were fabricated, and antibodies were covalently immobilized via 6-MHA SAM/EDC-NHS coupling chemistry. The fabricated biosensors specifically bound to the cell wall of S. aureus and B. cereus, exhibiting concentration-dependent impedance changes with excellent linearity (Adj. R2 ≥ 0.97) and low detection limit (LOD = 101 CFU·mL-1). Furthermore, EIS measurements were completed within approximately 10 minutes, demonstrating rapid and efficient detection performance. The two biosensors developed in this study were designed based on distinct recognition elements-peptides and antibodies-each providing complementary advantages for electrochemical detection. The antibody-based biosensor provides superior selectivity and stability, whereas the peptide-based biosensor offers simplicity of synthesis and cost efficiency. Both biosensors operate based on label-free electrochemical detection principles by monitoring interfacial changes induced by target binding without the use of external labels or chromogenic reactions. Therefore, this study presents versatile design strategies for multichannel electrochemical biosensors that can be selectively applied according to the application purpose, demonstrating strong potential for applications in clinical diagnostics, food safety monitoring, and environmental analysis.

국문 초록 (Abstract)

최근 환경 및 임상 분야에서의 세균 감염은 주요 사망 원인 중 하나로, 특히 그람양성균은 패혈증 및 식중독을 유발하여 의료비와 사망률을 증가시키는 요인으로 작용한다. 기존 배양 기반 진단법은 분석 시간이 길고, 분자진단 기술은 고가 장비와 숙련 인력을 필요로 하는 한계가 있다. 이에 본 연구에서는 다중채널 전극 구조를 응용한 전기화학 바이오센서들을 개발하였으며, 펩타이드 기반 (16-GDEs)과 항체 기반 (16-AuIWEs) 두 가지 전기화학 바이오센서를 설계하여 신속·비표지의 그람양성균 검출을 구현하였다. 펩타이드 기반 센서에서는 AuNPs@Ti3C2Tz 나노복합체를 도입한 16채널 금 디스크 전극 (16-GDEs)에 상보적 펩타이드 쌍을 고정화하여 민감도와 선택성을 향상시켰다. Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Micrococcus luteus를 대상으로 한 DPV 분석에서 로그 농도와 피크 전류 간의 높은 선형성 (Adj. R2 ≥ 0.93)을 확인하였으며, 5 × 102 CFU·mL-1의 검출 한계를 달성하였다. 항체 기반 바이오센서에서는 교차된 전극 간 간격이 10 μm인 16채널 금 물결형 교차 전극 (16-AuIWEs)을 제작하고, 6-MHA SAM/EDC-NHS 결합 화학을 통해 항체를 안정적으로 고정화하였다. 제작된 센서는 S. aureus와 B. cereus의 세포벽 항원과 특이적으로 결합하여 농도 의존적 임피던스 변화를 나타냈으며, Adj. R2 ≥ 0.97의 높은 선형성과 101 CFU·mL-1의 낮은 검출 한계를 확보하였다. 또한, EIS 측정은 약 10분 이내에 측정이 완료되어 신속한 검출 성능을 확인하였다. 본 연구에서 개발한 두 바이오센서는 서로 다른 인식체 (펩타이드와 항체)를 기반으로 설계되어, 각각의 장점을 살린 전기화학 검출을 실현하였다. 항체 기반 센서는 선택성과 안정성을, 펩타이드 기반 센서는 합성 용이성과 비용 효율성 측면에서 장점을 보였다. 두 센서는 외부 표지나 발색 반응 없이 타깃 결합에 따른 전극 계면 변화를 활용하는 비표지 (label-free) 전기화학 검출 원리를 따르므로, 응용 목적에 따라 선택적 활용이 가능하다. 따라서 본 연구는 다양한 조건과 분석 요구에 대응할 수 있는 다중채널 전기화학 바이오센서의 설계 전략을 제시하며, 임상 진단 및 식품 안전 관리 등 다양한 분야에서의 응용 가능성을 보여준다.

목차 (Table of Contents)

• 제 1 장 서 론 1
• 1.1. 그람양성균 검출 기술의 필요성 1
• 1.2. 이론 5
• 1.2.1. 전기화학 바이오센서 (Electrochemical Biosensor) 5
• 1.2.1.1. 전기화학 임피던스 분광법 (Electrochemical Impedance Spectroscopy, EIS) 8
• 1.2.1.2. 차등 펄스 전압법 (Differential Pulse Voltammetry, DPV) 11
• 1.2.1.3. 순환전압전류법 (Cyclic Voltammetry, CV) 13
• 1.2.2. 효소결합면역분석법 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 16
• 1.2.3. 이차원 (Two-Dimensional, 2D) 물질 및 바이오센서 응용 19
• 1.2.4. 금속나노입자 (Metallic Nanoparticles, MNPs) 21
• 제 2 장 펩타이드 기반 그람양성균 검출 바이오센서 24
• 2.1. 펩타이드 기반 그람양성균 검출의 필요성과 연구 목표 24
• 2.2. 재료 및 방법 25
• 2.2.1. 시약 및 재료 25
• 2.2.2. Ti3C2Tz 의 합성 26
• 2.2.3. 전기화학적 측정 27
• 2.2.4. 펩타이드 쌍의 특이적 결합을 확인하기 위한 ELISA 기반 분석 28
• 2.2.5. 16 채널 금 원형 전극 (16-GDEs) 제작 30
• 2.2.5.1. 전극 농도별 평가 33
• 2.2.5.2. 전극 재현성 평가 36
• 2.2.6. 16-GDEs 기반 샌드위치형 펩타이드 전기화학 바이오센서 제작 39
• 2.2.7. 통계 분석 (Statistical Analysis) 41
• 2.2.8. 그람양성균 교차 반응성 평가 41
• 2.3. 결과 및 고찰 42
• 2.3.1. AuNPs@Ti3C2Tz/16-GDEs 의 형태 및 전기화학적 특성 42
• 2.3.2. 바이오센서 실제 유효 표면적 (Real Surface Area, RSA) 계산 44
• 2.3.3. 상보적 펩타이드 페어를 이용한 샌드위치형 결합 기반 전기화학 바이오센서의 개발 46
• 2.3.4. 특이성 평가 (Specificity Test) 51
• 2.4. 결론 54
• 제 3 장 항체 기반 그람양성균 검출 바이오센서 56
• 3.1. 항체 기반 그람양성균 검출의 필요성과 연구 목표 56
• 3.2. 재료 및 방법 58
• 3.2.1. 시약 및 재료 58
• 3.2.2. 전기화학적 측정 59
• 3.2.3. 16 채널 금 물결형 교차 전극 (16-AuIWEs) 제작 61
• 3.2.3.1. 전극 농도별 평가 63
• 3.2.3.2. 전극 재현성 평가 65
• 3.2.4. 16-AuIWEs 기반의 전기화학 바이오센서 제작 68
• 3.3. 결과 70
• 3.3.1. 바이오센서의 전기화학적 특성 70
• 3.3.2. 항체 기반 바이오센서의 개발 72
• 3.4. 결론 76
• 제 4 장 최종 결론 (General Conclusion) 78
• 참고문헌 80
• 부록 106
• A1. 분석 기법 및 장비 106
• A2. 세균 배양 107
• ABSTRACT 118
• 연구 실적 및 특허 120