Inhibitory Effects of Angelica gigas Nakai on Inflammation, Pain and Cartilage Degradation in OA induced Rats

국문 초록 (Abstract)

목적: 본 연구에서는 참당귀 (Angelica gigas Nakai; AG) 추출물을 이용하여 MIA 로 유도된 골관절염 (Osteoarthritis; OA) 쥐 모델을 대상으로 생체 내 및 실험실 내 연구를 통해 OA의 주요 병태인 염증, 통증, 연골 손상 등을 억제하는지 살펴보고자 하였다. 방법: HPLC 분석을 통해 AG 추출물의 주요 활성 성분을 확인하였다. MIA를 무릎 관절강 내에 주입하여 쥐에서 골관절염을 유도하였다. AG를 경구 투여하며 체중부하능을 평가하였고, 양성 대조군으로는 indomethacin을 사용하였다. Macroscopic score를 통해 연골 손상도를 평가하였으며, 쥐의 혈청에서 염증성 사이토카인 농도를 측정하였다. 진통 효과는 아세트산으로 유도한 비틀기 모델을 이용하여 평가하였다. LPS 로 자극된 RAW264.7 대식세포와 OA 쥐의 무릎 연골 조직에서 염증성 사이토카인 및 연골 분해 관련 단백질의 발현을 qRT-PCR과 western blot으로 분석하였다. 결과 1. AG 의 유효 활성성분은 decursin 과 decursinol angelate 이었다. 2. MIA 유도 OA 쥐에서 24일 동안 AG 를 경구 투여한 경우 체중 부하능이 유의하 게 회복되었으며, indomethacin 과 유사하게 통증 억제 효과를 보였다. 3. 무릎 관절의 연골 상태를 형태학적으로 관찰한 결과, AG 투여군에서 연골 침식 정도가 유의하게 감소하였으며 indomethacin 과 유사하게 연골 손상을 억제하였다. 4. MIA 유도 OA 쥐에서 AG 투여군은 혈청 내 TNF-α, IL-1β 수치가 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다. 특히, AG 300 mg/kg 투여 시 indomethacin 보다 더 낮은 수준으로 그 발현이 억제되었다. 5. 아세트산 유발 통증 모델에서 AG 600 mg/kg 투여군은 ibuprofen 200 mg/kg 투여 군과 유사한 정도로 복부 비틀기 반응을 유의하게 감소시켰다. 6. LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 AG는 세포독성을 유발하지 않았으며, NO 생성 을 유의하게 감소시켰다. 7. LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 AG 와 dexamethasone 은 MMP1, MMP3, MMP8, MMP13, IL-1β, IL-6, TNF-α, COX-2, PTGER2, NOS2 의 mRNA 및 단백질 발현을 유의하게 감소시켰으며, AG의 항염 효과는 dexamethasone 과 유사하였다. 8. OA가 유도된 무릎 내 연골 조직에서 AG 와 indomethacin 은 MMP1, MMP3, MMP8, MMP13, IL-1β, IL-6, TNF-α, COX-2, PTGER2, NOS2 의 mRNA 및 단백질 발현 수준을 유의하게 감소시켰다. 결론: AG는 MIA로 유도된 OA 쥐 모델과 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 염증성 사이토카인과 연골 분해효소의 발현을 억제하였으며, 통증 완화와 연골 손상 완화에 도 기여하였다. 이는 OA의 핵심 병태생리에 관여하는 항염증, 진통, 연골 보호 작용을 통해 OA의 진행을 완화하는 가능성을 보여주며, DMOAD 후보로서 잠재력을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• Ⅱ. Materials and Methods 3
• 1. Preparation of AG Extract(AGE) 3
• 2. Analysis of AGE utilizing High Performance Liquid Chromatography 4
• 3. Experimental Animals and Groups including in vivo and in vitro 5
• 4. Acetic Acid induced Writhing Response(AAWR) 9
• 5. AGE Oral Administration in Osteoarthritis induced Rats 10
• 6. Incapacitance Test in OA induced Rats 11
• 7. Assessment of Chondral Degradation in OA induced Rats 12
• 8. Serum Analysis in OA induced Rats 14
• 9. Cell Culture· 15
• 10. Cell Viability Assay 16
• 11. Nitric oxide(NO) Assay 17
• 12. Measurement of mRNA Expression Levels using qRT-PCR 18
• 13. Western blot Assay 21
• 14. Statistical Analysis 22
• Ⅲ. Results 23
• 1. HPLC Analysis 23
• 2. Effects of AGE on Acetic Acid Writhing Response 24
• 3. Effects of AGE on Weight Bearing in OA induced Rats 26
• 4. Effects of AGE on Cartilage Damage in the Knee Joint of OA induced Rats 29
• 5. Effects of AGE on TNF-α in the Serum of OA induced Rats 31
• 6. Effects of AGE on IL-1β in the Serum of OA induced Rats 33
• 7. Effects of AGE on mRNA Expression of IL-1β in the Cartilage of OA induced Rats 35
• 8. Effects of AGE on mRNA Expression of IL-6 in the Cartilage of OA induced Rats 37
• 9. Effects of AGE on mRNA Expression of NOS2 in the Cartilage of OA induced Rats 39
• 10. Effects of AGE on mRNA Expression of PTGER2 in the Cartilage of OA induced Rats 41
• 11. Effects of AGE on mRNA Expression of MMP1 in the Cartilage of OA induced Rats 43
• 12. Effects of AGE on mRNA Expression of MMP3 in the Cartilage of OA induced Rats 45
• 13. Effects of AGE on mRNA Expression of MMP8 in the Cartilage of OA induced Rats 47
• 14. Effects of AGE on mRNA Expression of MMP13 in the Cartilage of OA induced Rats 49
• 15. Effects of AGE on TNF-α in the Cartilage of OA induced Rats 51
• 16. Effects of AGE on COX-2 in the Cartilage of OA induced Rats 53
• 17. Effects of AGE on IL-1β in the Cartilage of OA induced Rats 55
• 18. Effects of AGE on IL-6 in the Cartilage of OA induced Rats 57
• 19. Effects of AGE on NOS2 in the Cartilage of OA induced Rats 59
• 20. Effects of AGE on MMP3 in the Cartilage of OA induced Rats 61
• 21. Effects of AGE on MMP13 in the Cartilage of OA induced Rats 63
• 22. Effects of AGE on TNF-α in the Cartilage of OA induced Rats 65
• 23. Effects of AGE on COX-2 in the Cartilage of OA induced Rats 67
• 24. Effects of AGE on Cell Viability in the Macrophage 69
• 25. Effects of AGE on Nitric Oxide Generation in the LPS-treated Macrophage in vitro 71
• 26. Effects of AGE on mRNA Expression of IL-1β in the LPS-treated Macrophage in vitro·· 73
• 27. Effects of AGE on mRNA Expression of IL-6 in the LPS-treated Macrophage in vitro· 75
• 28. Effects of AGE on mRNA Expression of NOS2 in the LPS-treated Macrophage in vitro 77
• 29. Effects of AGE on mRNA Expression of PTGER2 in the LPS-treated Macrophage in vitro· 79
• 30. Effects of AGE on mRNA Expression of MMP1 in the LPS-treated Macrophage in vitro 81
• 31. Effects of AGE on mRNA Expression of MMP3 in the LPS-treated Macrophage in vitro 83
• 32. Effects of AGE on mRNA Expression of MMP8 in the LPS-treated Macrophage in vitro 85
• 33. Effects of AGE on mRNA Expression of MMP13 in the LPS-treated Macrophage in vitro·· 87
• 34. Effects of AGE on mRNA Expression of TNF-α in the LPS-treated Macrophage in vitro· 89
• 35. Effects of AGE on mRNA Expression of COX-2 in the LPS-treated Macrophage in vitro·· 91
• 36. Effects of AGE on IL-1β in the LPS-treated Macrophage in vitro 93
• 37. Effects of AGE on IL-6 in the LPS-treated Macrophage in vitro· 95
• 38. Effects of AGE on MMP3 in the LPS-treated Macrophage in vitro 97
• 39. Effects of AGE on TNF-α in the LPS-treated Macrophage in vitro· 99
• Ⅳ. Discussion 101
• References 105