Freeze?thaw effects on single- and dual-species biofilms of Listeria monocytogenes and Pseudomonas aeruginosa formed on food-processing surfaces = 식품 가공 표면에 형성된 Listeria monocytogenes 및 Pseudomonas aeruginosa 단일 및 이중종 생물막의 동결-해동 영향

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

This study aimed to evaluate how biofilm composition influences microbial survival during freeze–thaw processes that simulate frozen food processing environments, in order to assess potential food safety risks. Specifically, single-species biofilms of Listeria monocytogenes (LM) and Pseudomonas aeruginosa (PA) and dual-species biofilms (LP) were formed on stainless-steel surfaces. Each biofilm was subjected to freezing at −80°C (RF) or −20°C (SF), followed by thawing at 4°C (CT) or 25°C (RT). LM, which contained less extracellular polymeric substances (EPS), showed reduced biomass after freeze–thaw. However, PA and LP, both rich in EPS, exhibited little loss of biomass. Among the freeze–thaw conditions, the highest viable cell counts for LM and PA were observed under the SF–CT condition (4.79 ± 0.22 and 7.67 ± 0.17 Log CFU/cm², respectively). Larger temperature fluctuations, such as RF–RT, increased cell damage and depolarization, leading to cell death. In contrast, LP, which contained the highest amount of EPS, showed no significant differences among freeze–thaw conditions. Notably, L. monocytogenes in LP was protected through interactions with P. aeruginosa, maintaining viability after freeze–thaw exposure. Furthermore, virulence-related gene expression increased in all biofilms following treatment. These findings indicate that EPS maintain biofilm structural stability and protect cells from temperature fluctuations, suggesting that biofilms may act as potential food safety hazards in frozen food processing environments. Therefore, developing advanced control strategies that integrate microbial interactions and biofilm dynamics is essential to ensure hygiene in processing facilities.

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 냉동식품 가공환경을 모사한 동결-해동 과정에서 바이오필름의 조성이 미생물 생존성에 미치는 영향을 평가하여 잠재적인 식품안전 위험성을 확인하고자 수행되었다. 이를 위해 리스테리아 모노사이토제네스 단일 생물막(LM) 및 슈도모나스 에루지노사 단일 생물막(PA)과 두 균이 함께 형성한 이중종 생물막(LP)을 스테인리스 스틸 표면에 형성하였다. 각 생물막은 −80°C의 급속동결(RF) 또는 −20°C의 완만동결(SF) 후 4°C의 냉장해동(CT) 또는 25°C의 실온해동(RT)을 거쳤다. 세포외고분자물질 함량이 적은 LM은 동결-해동 후 생물량이 감소하였으나, EPS가 풍부한 PA와 LP은 생물량 손실이 거의 없었다. SF-CT 조건에서 LM과 PA는 각각 4.79 ± 0.22 및 7.67 ± 0.17 Log CFU/cm²로 동결-해동 조건 중 생존 가능한 세포 수가 가장 높게 유지되었다. RF-RT 조건과 같은 급격한 온도 변화는 세포 손상과 막 탈분극을 증가시켜 세포 사멸을 초래하였다. 반면, 가장 많은 세포외고분자물질을 함유한 LP는 동결-해동 조건 간 유의한 차이를 보이지 않았다. 특히 LP의 리스테리아 모노사이토제네스는 슈도모나스 에루지노사와의 상호작용을 통해 보호되어 동결-해동 노출 후에도 생존력을 유지했다. 또한, 모든 생물막에서 병원성 관련 유전자 발현이 증가하였다. 이러한 결과는 세포외고분자물질이 생물막의 구조적 안정성을 유지하고 온도 변화로부터 세포를 보호함으로써, 생물막이 냉동식품 가공환경에서 잠재적인 식품안전 위해 요인으로 작용할 수 있음을 시사한다. 따라서 미생물 간 상호작용과 생물막의 특성을 통합적으로 고려한 고도화된 제어 전략의 개발이 식품가공시설의 위생 확보에 필수적이다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials and methods 4
• 2.1. Bacterial strains and cultivation 4
• 2.2. Biofilm formation 4
• 2.3. Freezing and thawing treatment 4
• 2.4. Crystal violet (CV) assay 7
• 2.5. EPS quantification 7
• 2.6. Viable cell count and proportion of injured cells 8
• 2.7. Membrane damage and membrane potential assays after freeze–thaw treatment 8
• 2.7.1. Membrane damage assay 8
• 2.7.2. Membrane potential assay 9
• 2.7.3. Confocal laser-scanning microscopy (CLSM) 10
• 2.8. Motility assay 10
• 2.9. Gene expression analysis 11
• 2.10. Statistical analysis 13
• 3. Results 14
• 3.1. Comparative biofilm formation and EPS contents on SS coupons 14
• 3.2. Effects of freeze–thaw on biofilm biomass 16
• 3.3. Cell injury and survival in biofilms after freezing and thawing 18
• 3.4. Effects of freeze–thaw treatment on the structural integrity and functional state of biofilm cell membranes 21
• 3.5. Biofilm-derived cell motility after freeze–thaw treatment 25
• 3.6. Gene expression in biofilms after freeze–thaw treatment 27
• 4. Discussion 29
• 5. Conclusion 35
• References 36
• 국문요약 45