Development of DNA triplex-based nanoprobe for intracellular transcription monitoring = 삼중나선 DNA 기반 나노프로브를 이용한 세포 내 전사 모니터링

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Cellular processes such as metabolism, differentiation, and immune responses are regulated by gene regulation, making transcription monitoring essential for interrogating these phenomena in living systems. However, most existing transcription-monitoring approaches operate at the mRNA or protein level and often require cell lysis or consume target mRNA. Moreover, direct transcription monitoring at the DNA level remains limited. Here, we develop a triplex forming oligonucleotide (TFO)-based DNA triplex nanoprobe, termed Triplex based Reporter for Intracellular Transcription (TRIT), to enable non-destructive and non- consumptive transcription monitoring in living cells. TRIT integrates a purine TFO–dsDNA fluorophore–quencher pair with a nuclear-delivery-capable carrier and is designed to function stable under physiological pH conditions, leveraging the intrinsic properties of purine TFOs. In the quenched TFO–dsDNA triplex state, transcriptional activation increases chromatin accessibility, allowing the TFO to approach to an exposed genomic target sequence and thereby the fluorescence intensity increases. Consequently, treating transcriptionally active cells with TRIT results in enhanced nuclear fluorescence, reflecting probe activation driven by target engagement. This mechanism provides a route to intracellular transcription monitoring in living cells without cell destruction or mRNA consumption.

국문 초록 (Abstract)

세포 내에서 발생하는 대사, 분화, 면역 반응 등 여러가지 현상은 유전자 조절에 의해 발생한다. 따라서 해당 현상들을 확인하기 위해서는 이와 직결되는 전사를 모니터링하는 것이 필수적인 일이다. 현재 존재하는 전사 모니터링 기술로는 분석형 모니터링, in situ 모니터링 기술들이 존재하나, 해당 기술들은 mRNA 수준이나 단백질, 아미노산 수준에서 이루어지며 세포 용해를 요구하거나 mRNA 를 소모하는 등의 단점이 존재한다. 더 나아가, 현재 DNA 수준에서의 전사 모니터링 기술은 아직 개발되지 않았다. 따라서 이 한계를 극복하기 위해, 우리는 triplex forming oligonucleotide (TFO) 기반 DNA 삼중나선 프로브를 이용해 Triplex-based Reporter for Intracellular Transcription (TRIT)를 개발해 세포 파괴 및 mRNA 소모 없이 DNA 수준에서의 전사 모니터링 기술을 개발하였다. 본 프로브는 퓨린 TFO-dsDNA 형광소광 페어와 세포 핵 내 전달을 매개하는 운반체를 통합하였으며, 퓨린 TFO 의 특성에 따라 생리적 pH 에서 안정적으로 작동한다. Hoogsteen 결합으로 형성된 TFO-dsDNA 상태에서 전사가 활성화되면 크로마틴 접근성이 증가하고, TFO 가 노출된 표적 서열로 이동하게 되면서 형광신호가 증가한다. 따라서 프로브를 전사가 진행 중인 세포에 처리하면, 핵 접근 및 TFO 와 타겟 서열의 결합에 따른 프로브 활성화로 인해 형광세기가 증가한다. 이 메커니즘은 살아있는 세포에서 전사를 비파괴적, 비소모적으로 모니터링할 수 있도록 한다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 2. Materials & Methods 5
• Reagent 5
• 2.1 Selection of TFO for monitoring RUNX2 gene 5
• 2.2 Optimization of forming condition for DNA triplex 5
• 2.3 Native page 5
• 2.4 Optimization of TFO condition for Migration to the Target 6
• 2.5 Synthesis of triplex probe 6
• 2.6 Dynamic light scattering (DLS) 6
• 2.7 Zeta potential 7
• 2.8 Transmission Electron Microscopy (TEM) 7
• 2.9 Cell culture 7
• 2.10 Alizarin red S staining 8
• 2.11 RT-qPCR analysis 8
• 2.12 Immunostaining 8
• 2.13 In vitro Cell viability assay 9
• 2.14 Fluorescence microscopy analysis for confirming triplex probe activation 9
• 2.15 Live cell imaging 9
• 2.16 Western blot 9
• 3. Results and Discussion 14
• 3.1 Optimization of conditions for DNA triplex formation 14
• 3.2 Confirmation of DNA-triplex–mediated turn-on fluorescence signal 19
• 3.3 Confirmation of triplex-probe formation and stability 22
• 3.4 Comparative profiling of RUNX2 expression patterns and probe activation dynamics during osteogenesis 27
• 3.5 Validation of non-consumptive mRNA monitoring with no inhibition of protein expression 31
• 4. Conclusion 35
• 5. Reference 36
• 6. Abstract in Korean 39