Concentration Distributions of Isoniazid and Its Four Major Metabolites in Korean Patients = 한국 결핵 환자에서 이소니아지드 및 네 가지 주요 대사체의 농도 분포

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Objective: Isoniazid (INH) remains a cornerstone drug in tuberculosis (TB) therapy, but its clinical response and hepatotoxicity vary widely among patients due to differences in metabolic pathways. This study aimed to (1) develop and validate a robust LC–MS/MS method for simultaneous quantification of INH and its four major metabolites—acetylisoniazid (AcINH), isonicotinic acid (INA), hydrazine (HZ), and acetylhydrazine (AcHZ)—in human plasma; (2) characterize exposure distributions, variability, and metabolic ratios of these analytes in a large cohort of Korean TB patients.
Methods: A dual LC–MS/MS analytical strategy was developed to quantify INH and its metabolites in plasma. INH, AcINH, and INA were analyzed after protein precipitation, while HZ and AcHZ were derivatized with p-tolualdehyde to form stable hydrazones. The method was validated following FDA bioanalytical criteria. The validated assay was applied to 824 plasma samples from 776 Korean TB patients obtained from the multicenter cPMTb cohort. Concentrations, normalized to an equivalent 300 mg INH dose, were analyzed by time-after-dose windows (centered at 2 ± 0.5 h and 3 ± 0.5 h). Pathway-based molar ratios were calculated to represent acetylation and hydrolysis pathways.
Results: The LC–MS/MS method demonstrated excellent linearity for all five analytes over clinically relevant ranges, with accuracy and precision within regulatory limits and robust performance. Across 0–24 h, median (range) concentrations (µM) were: INH 10.6 (0.29–61.6), AcINH 13.8 (0.22–51.6), INA 7.5 (0.32–39.1), HZ 0.3 (0.02–1.46), AcHZ 4.8 (0.26–15.7). INH and AcINH dominated early after dosing, whereas INA and AcHZ showed more delayed and sustained presence and HZ remained low but measurable throughout the 24-hour period.
At approximately 2 h post-dose, the majority of rapid acetylators had INH concentrations below the conventional therapeutic range (3–6 µg/mL), whereas slow acetylators more often fell within or above this window; by 3 h, INH levels exceeding the suggested toxicity cut-off of 3.69 µg/mL were observed predominantly in slow acetylators. HZ concentrations were generally higher in slow acetylators, and AcHZ showed a phenotype-specific temporal pattern, being relatively lower in slow acetylators during the early post-dose period but relatively higher at later times, consistent with delayed accumulation.
Acetylation-linked indices (AcINH/INH and (AcINH+AcHZ)/(INH+HZ)) increased with greater NAT2 acetylation capacity, clearly differentiating slow, intermediate, and rapid phenotypes. The hydrolysis-linked INA/(INH+AcINH) ratio also increased from slow to rapid acetylators, supporting AcINH hydrolysis as a dominant contributor to INA formation. In contrast, hydrazine-focused ratios HZ/INH and (HZ+AcHZ)/(INH+AcINH) showed no significant differences between phenotypes, suggesting that hydrazine generation itself is less dependent on NAT2 activity. Notably, the AcHZ/AcINH ratio was substantially higher in slow acetylators, indicating reduced secondary acetylation of AcHZ to non-toxic diacetylhydrazine and a greater relative propensity for AcHZ accumulation in this group.
Conclusion: This thesis establishes a validated LC–MS/MS platform and provides the first large-scale dataset describing INH and its major metabolites in Korean TB patients. The concentration distributions and ratio profiles characterize real-world variability in INH metabolism. This work established a quantitative foundation for future pharmacogenetic and model-informed dosing studies.

국문 초록 (Abstract)

목적: 이소니아지드(INH)는 결핵(TB) 치료의 핵심 약물이지만, 대사 경로의 차이로 인해 환자 간 임상 반응과 간독성 발생 위험이 크게 달라진다. 본 연구의 목적은 (1) INH와 그 네 가지 주요 대사체—아세틸이소니아지드(AcINH), 이소니코틴산(INA), 하이드라진(HZ), 아세틸하이드라진(AcHZ)—을 인체 혈장에서 동시에 정량하기 위한 견고한 LC–MS/MS 분석법을 개발·검증하고, (2) 한국인 결핵 환자를 대상으로 이들 분석물질의 노출 분포, 변동성, 대사 비율을 정량적으로 규명하는 것이다.
방법: INH 및 네 가지 대사체를 정량하기 위해 이중 LC–MS/MS 분석 전략을 구축하였다. INH, AcINH, INA는 단백질 침전 후 분석하였고, HZ와 AcHZ는 p-톨루알데하이드로 유도체화하여 안정한 하이드라존 형태로 측정하였다. 분석법은 FDA 생물분석 가이드라인에 따라 검증되었다. 검증된 방법은 다기관 cPMTb 코호트에서 확보한 한국인 결핵 환자 776명의 혈장 시료 824건에 적용되었다. 농도는 300 mg INH 용량 기준으로 정규화하였으며, 2 ± 0.5시간 및 3 ± 0.5시간 시점 중심의 시간 구간별로 분석하였다. 또한 아세틸화 및 가수분해 경로를 반영하기 위해 경로 기반 몰비를 산출하였다.
결과: LC–MS/MS 분석법은 임상적으로 유의한 농도 범위 전반에서 우수한 직선성과 규제 기준을 충족하는 정확도·정밀도를 보였다. 0–24시간 동안의 중앙값(범위, µM)은 INH 10.6 (0.29–61.6), AcINH 13.8 (0.22–51.6), INA 7.5 (0.32–39.1), HZ 0.3 (0.02–1.46), AcHZ 4.8 (0.26–15.7)이었다. INH와 AcINH는 투여 초기 농도를 주도하였고, INA와 AcHZ는 보다 지연되고 지속적인 양상을 보였으며, HZ는 모든 시점에서 낮으나 측정 가능한 수준을 유지하였다.
투여 약 2시간 시점에서 빠른 아세틸화형의 대부분은 INH 농도가 기존 치료범위(3–6 µg/mL)보다 낮았던 반면, 느린 아세틸화형은 치료범위 내 또는 그 이상에 위치하는 경우가 더 많았다. 투여 3시간 시점에서는 제안된 독성 기준치(3.69 µg/mL)를 초과하는 INH 농도가 주로 느린 아세틸화형에서 관찰되었다. HZ는 느린 아세틸화형에서 전반적으로 더 높았으며, AcHZ는 초기에는 느린 아세틸화형에서 낮게 나타났다가 후기에는 상대적으로 더 높은 농도를 보여 지연된 축적 양상을 시사하였다.
아세틸화 관련 지표(AcINH/INH, (AcINH+AcHZ)/(INH+HZ))는 NAT2 아세틸화 능력이 증가할수록 높아져 느린–중간–빠른 아세틸화형을 명확히 구분하였다. 가수분해 관련 지표인 INA/(INH+AcINH) 또한 느린 아세틸화형에서 빠른 아세틸화형으로 증가하여 AcINH 가수분해가 INA 생성의 주요 경로임을 뒷받침하였다. 반면, HZ/INH 및 (HZ+AcHZ)/(INH+AcINH)와 같은 하이드라진 중심의 지표는 아세틸화형 간 유의한 차이를 보이지 않아, 하이드라진 생성 자체는 NAT2 활성의 영향을 덜 받는 것으로 판단되었다. 특히 AcHZ/AcINH 비율은 느린 아세틸화형에서 크게 증가하여, AcHZ가 비독성 대사산물인 다이아세틸하이드라진으로 전환되는 2차 아세틸화 과정이 덜 효율적임을 나타내었다
결론: 본 연구는 한국인 결핵 환자에서 INH 및 주요 대사체의 대규모 실세계 농도 데이터를 제시한 첫 연구로, 동시에 검증된 LC–MS/MS 분석 플랫폼을 확립하였다. 농도 분포와 대사 비율 분석은 INH 대사의 실제 변동성을 명확히 보여주며, 향후 약물유전학 연구 및 모델 기반 개인맞춤 용량조절 전략 개발을 위한 정량적 근거를 제공한다.

목차 (Table of Contents)

• List of Tables iii
• List of Figures i
• I. Introduction 1
• II. Objectives 7
• Chapter I: Development and Validation of an LC–MS/MS Method for Simultaneous Quantification of Isoniazid and Its Four Major Metabolites Including Acetylisoniazid, Isonicotinic Acid, Hydrazine, And Aceylhydrazine in Human Plasma. 8
• 1. Introduction 10
• 2. Materials and methods 12
• 2.1. Chemicals and materials 12
• 2.2. Preparation of standards and quality controls samples 12
• 2.3. Sample preparation 13
• 2.4. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry 14
• 2.5. Method validation 16
• 3. Results 19
• 3.1. Method Optimization for the LC and MS conditions 19
• 3.2. Method validation 22
• 4. Conclusion 33
• Chapter II: Distribution Of Isoniazid and Four Major Metabolites Plasma Concentrations Including Acetylisoniazid, Isonicotinic Acid, Hydrazine, And Aceylhydrazine in Korean Patients Taking Isoniazid-Based Therapy. 37
• 1. Introduction 39
• 2. Materials and methods 42
• 2.1. Data collection and study population used in this thesis 43
• 2.2. Quantification of plasma INH and four main metabolites 45
• 2.3. Data exploration and statistical analysis 46
• 3. Results 51
• 3.1. Study population characteristics 51
• 3.2. Distribution of INH and Metabolite Exposure at Selected Post
• Dose Time Intervals 56
• 3.3. Variability and Temporal Trends of Hydrolysis- and Acetylation- Linked Molar Ratios 63
• III. Discussion 68
• IV. Conclusion 74
• References 76
• Acknowledgements 81