일본뇌염바이러스 구조·비구조 단백질 표적 siRNA의 단일 및 다중 처리에 따른 항바이러스 효능 평가 = Evaluation of the antiviral efficacy of single and multi-target siRNA strategies targeting structural and non-structural proteins of Japanese encephalitis virus

국문 초록 (Abstract)

일본뇌염바이러스는 플라비바이러스 속에 속하는 양성 단일 가닥 RNA 바이러스로, 일본뇌염의 주요 원인체이다. 백신 접종이 주요 예방 수단이며, 임상적으로 승인된 항바이러스제는 없어 새로운 치료제 개발 전략이 요구된다. 본 연구에서는 일본뇌염바이러스의 감염 및 복제에 필수적인 prM, NS1, NS3, NS5 유전자를 표적으로 하는 소간섭 RNA를 설계하고, 그 항바이러스 효과를 세포 모델에서 평가하였다. 헬라 세포에 소간섭 RNA를 도입한 후 일본뇌염바이러스를 감염시켜 바이러스 역가, 단백질 발현, 세포 생존율을 분석하였으며, 각 단백질별 소간섭 RNA를 조합한 칵테일 소간섭 RNA의 효능도 함께 비교하였다. 그 결과, 두 소간섭 RNA 처리군 모두 일본뇌염바이러스의 복제 및 단백질 합성을 유의하게 억제하고 세포 생존율을 향상시켰으며, 인터페론 경로의 비특이적 활성은 관찰되지 않았다. 특히 칵테일 소간섭 RNA 처리군에서 더 높은 항바이러스 효능이 확인되었다. 이러한 결과는 RNA 간섭 기술이 일본뇌염바이러스 복제를 효과적으로 차단할 수 있고, 소간섭 RNA 다중 처리 전략은 보다 나은 항바이러스 전략이 될 수 있음을 시사한다. 본 연구는 향후 플라비바이러스 감염 치료를 위한 RNA 간섭 기반 항바이러스제 개발의 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Japanese encephalitis virus (JEV) is a positive-sense, single-stranded RNA virus belonging to the genus Flavivirus and is the primary causative agent of Japanese encephalitis (JE). JE was first described during an outbreak in Japan in 1871 and subsequently spread throughout Southeast Asia and the Western Pacific region. In South Korea, the first documented JE case was reported in 1947, and the disease has since been recognized as an endemic public health concern. JEV infection is mainly transmitted through Culex mosquitoes and remains endemic in many parts of Asia and the Pacific. Although vaccination is currently the most effective preventive measure, uneven vaccination coverage and the potential emergence of vaccine escape variants emphasize the urgent need for effective therapeutic agents. To date, no clinically approved antiviral drugs are available for the treatment of JEV infection, highlighting the necessity for novel molecular therapeutic approaches. RNA interference (RNAi) is a highly specific post-transcriptional gene silencing mechanism that mediates the degradation of target mRNA through sequence-complementary double-stranded RNA. Owing to its specificity and versatility, RNAi technology has been extensively explored as a potential therapeutic strategy for the treatment of cancers, genetic disorders, and viral infections. In this study, small interfering RNAs (siRNAs) were rationally designed to target the precursor membrane (prM), NS1, NS3, and NS5 genes of JEV, which encode essential structural and nonstructural proteins required for viral replication and assembly. The siRNA target sequences were selected based on the full-length JEV genomic sequence, and potential off-target effects were minimized through bioinformatic screening. Following transfection of HeLa cells with individual siRNAs, cells were subsequently infected with JEV. Antiviral efficacy was evaluated using plaque assays, western blotting, immunofluorescence analysis, and cell viability assays. The results demonstrated that siRNAs targeting prM, NS1, NS3, and NS5 significantly suppressed viral replication and viral protein expression while maintaining high cellular viability compared to control groups. To further enhance antiviral potency, a multi-target siRNA cocktail was constructed by combining the most effective siRNAs targeting distinct viral genes. The cocktail treatment exhibited stronger antiviral activity and greater cytoprotective effects than any individual siRNA treatment. The superior antiviral efficacy of the siRNA cocktail is presumed to result from the simultaneous and synergistic inhibition of multiple stages of the viral replication cycle by targeting both structural and nonstructural genes. Additionally, western blot analysis of Protein Kinase R (PKR) and phosphorylated PKR (p-PKR) revealed that neither individual nor cocktail siRNA treatments induced significant nonspecific activation of the interferon signaling pathway, indicating that the observed antiviral effects were primarily mediated through sequence-specific RNAi rather than off-target immune responses. Collectively, this study demonstrates the efficacy of RNAi-based antiviral strategies against JEV and highlights the advantage of a multi-target siRNA cocktail approach for enhancing antiviral potency and reducing the risk of viral escape. The siRNA design and validation framework established in this study provides a potential platform applicable to other Flavivirus members, including dengue and Zika viruses. Overall, this work provides foundational evidence supporting the development of RNAi-based molecular therapeutics as a novel antiviral strategy beyond conventional vaccine-based prevention.

목차 (Table of Contents)

• 국 문 초 록 i
• 목 차 ii
• 표 목 차 iv
• 그 림 목 차 v
• 제 1장 서론 1
• 1.1. 일본뇌염바이러스 1
• 1.2. 소간섭 RNA 5
• 1.3. 연구 목적 및 필요성 8
• 제 2장 실험 재료 및 방법 10
• 2.1. 세포 및 일본뇌염바이러스 10
• 2.2. 소간섭 RNA 설계 15
• 2.3. 소간섭 RNA 형질감염 (siRNA transfection) 18
• 2.4. 세포 생존율 평가 (Cell viability assay) 19
• 2.5. 플라크 어세이 (Plaque assay) 20
• 2.6. 웨스턴 블랏 (Western blotting) 21
• 2.7. 면역 형광 염색 (Immunofluorescence assay) 23
• 2.8. 통계 처리 24
• 제 3장 연구 결과 25
• 3.1. 일본뇌염바이러스 표적 소간섭 RNA의 설계 25
• 3.2. 세포 독성 최소화를 위한 소간섭 RNA 농도 최적화 28
• 3.3. 일본뇌염바이러스 표적 소간섭 RNA 단일 처리를 통한 바이러스 복제 억제 32
• 3.3.1. 웨스턴 블랏을 통한 바이러스 단백질 발현 및 인터페론 경로 활성 비교 33
• 3.3.2. 플라크 어세이를 통한 바이러스 역가 비교 37
• 3.4. 일본뇌염바이러스 표적 소간섭 RNA 칵테일 처리를 통한 바이러스 복제 억제 41
• 3.4.1. 소간섭 RNA 칵테일 처리의 세포 독성 확인 44
• 3.4.2. 웨스턴 블랏을 통한 바이러스 단백질 발현 및 인터페론 경로 활성 비교 47
• 3.4.3. 면역 형광 염색을 통한 바이러스 감염 및 복제 수준 비교 51
• 3.4.4. 플라크 어세이를 통한 바이러스 역가 비교 55
• 제 4장 토의 및 결론 57
• 참고문헌 62
• Abstract 69