간암세포에서 TIMP-3 조절 miRNA 발굴을 통한 소라페닙 내성 극복

국문 초록 (Abstract)

간세포암 (HCC)은 치명률이 매우 높은 악성종양으로, 진행성·전이성 HCC에서 표준 전신 치료제로 소라페닙이 사용된다. 그러나 소라페닙의 장기 사용은 내성 문제를 초래하므로, 소라페닙에 대한 후천적 내성은 여전히 중요한 치료적 난제이다. 내성의 기전을 규명하기 위해 소라페닙 내성 HCC 세포의 전사체 프로파일링을 수행한 결과, 유사분열 조절, 크로마틴 재구성, 세포사 신호전달 등 종양 진행과 관련된 과정들이 두드러지게 강화되어 있었다. 특히 이들 세포에서는 침습 및 상피-중간엽 전이(Ephithelial-Mesenchymal Transition; EMT)를 조절하는 것으로 알려진 종양억제인자 TIMP3(조직 금속단백분해효소 억제제-3)의 발현이 현저히 감소되어 있었다. 기능적 연구에서 TIMP3 과발현(overexpression; OV)은 세포 생존력과 암 줄기성 관련 단백질, 주요 세포주기 조절자를 억제하는 반면, 세포사와 관련된 단백질 발현은 증가시켰다. 반대로 TIMP3 발현 억제(knockdown; KD)는 증식, 암 줄기성, EMT를 강화시켰다. EMT 표지자는 TIMP3 과발현 HCC 세포에서 감소했지만 TIMP3 발현 억제 HCC 세포에서는 증가했으며, 이는 spheroid sprouting assay 결과와 일치하여 TIMP3가 종양의 공격성을 제어하는 역할을 함을 보여주었다. 상위 조절자를 탐색하기 위해 in silico 예측과 실험적 검증을 통합한 결과, miR-149-3p가 TIMP3의 새로운 억제자임을 확인하였다. miR-149-3p의 과발현은 TIMP3 발현을 감소시키고 EMT 및 침습을 촉진한 반면, miR-149-3p의 억제는 TIMP3 발현을 회복시키고 세포 이동을 억제하였다. TCGA 데이터셋과 HCC tissue microarray를 이용한 임상 분석에서 TIMP3는 정상 간 조직에 비해 종양에서 발현이 유의하게 낮았으며, Ki67과 CD44를 포함한 증식 또는 암 줄기성 표지자들과 역상관관계를 보였다. 종합하면, miR-149-3p가 매개하는 TIMP3 억제가 HCC에서 소라페닙 내성, EMT, 암 줄기성을 촉진하는 기전 축을 형성함을 입증하였다. 본 연구는 TIMP3가 종양 공격성의 핵심 결정인자임을 밝히고, TIMP3를 회복하거나 그 하위 경로를 표적화하는 것이 내성 극복을 위한 전략이 될 수 있음을 시사한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly lethal malignancy in which acquired resistance to sorafenib remains a major therapeutic challenge. To investigate mechanisms of resistance, we performed transcriptomic profiling of sorafenib-resistant HCC cells, which revealed enrichment of processes related to tumor progression, including mitotic regulation, chromatin remodeling, and apoptotic signaling. Notably, these cells displayed marked downregulation of tissue inhibitor of metalloproteinases-3 (TIMP3), a tumor suppressor known to regulate invasion and epithelial–mesenchymal transition (EMT). Functional studies showed that TIMP3 overexpression (OV) suppressed cell viability, stemness-associated proteins, and a key cell cycle regulator, while upregulating apoptosis-related proteins. Conversely, TIMP3 knockdown (KD) enhanced proliferation, stemness, and EMT. EMT markers were reduced in TIMP3-OV cells but increased with TIMP3-KD, consistent with spheroid sprouting assays, highlighting TIMP3 as a brake on aggressiveness. To explore upstream regulators, we integrated in silico predictions with validation, identifying miR-149-3p as a novel repressor of TIMP3. miR-149-3p overexpression reduced TIMP3 levels and promoted EMT and invasion, whereas inhibition of miR-149-3p restored TIMP3 expression and suppressed migration. Clinical analyses using TCGA datasets and HCC tissue microarrays confirmed significantly lower TIMP3 expression in tumors compared with normal liver tissue and showed inverse correlations between TIMP3 and proliferative or stemness markers, including Ki67 and CD44. Collectively, these findings establish a mechanistic axis in which miR-149-3p–mediated suppression of TIMP3 promotes sorafenib resistance, EMT, and stemness in HCC. This work identifies TIMP3 as a pivotal determinant of tumor aggressiveness and suggests restoring TIMP3 or targeting downstream pathways as strategies to overcome resistance.

목차 (Table of Contents)

• 국문초록 i
• 목 차 iii
• 표 목 차 v
• 그림목차 vi
• 제 1장 서론 1
• 제 2장 연구방법 4
• 2.1. 화학물질 4
• 2.2. 세포주 4
• 2.3. 형질주입 4
• 2.4. RNA sequencing and TCGA analysis 5
• 2.5. Western blotting 6
• 2.6. Cell viability 8
• 2.7. Migration assay and spheroid sprouting assay 8
• 2.8. Immunohistochemistry 9
• 2.9. Statistical analysis 9
• 제 3장 연구결과 10
• 3.1. SK-Hep1 및 SK-Hep1SR의 RNA seq 분석 10
• 3.2. SK-Hep1 및 SK-Hep1SR의 TIMP3 발현 비교 12
• 3.3. TIMP3 가 세포 생존율과 세포 주기 조절에 미치는 영향 14
• 3.3.1. SK-Hep1SR 세포에서 TIMP3의 과발현 14
• 3.3.2. SK-Hep1 세포에서 TIMP3의 발현 억제 16
• 3.4. TIMP3가 EMT와 세포 이동성에 미치는 영향 18
• 3.4.1. SK-Hep1SR 세포에서 TIMP3의 과발현 18
• 3.4.2. SK-Hep1 세포에서 TIMP3의 발현 억제 21
• 3.5. TIMP3 발현을 조절하는 miRNA 발굴 24
• 3.5.1. TIMP3 발현을 조절하는 miRNA 선정 24
• 3.5.2. miRNA를 통한 SK-Hep1SR 세포의 TIMP3 과발현 26
• 3.5.3. miRNA를 통한 SK-Hep1 세포의 TIMP3 발현 억제 30
• 3.6. HCC 환자에서 TIMP3 발현과 Ki-67, CD44 간의 상관관계 34
• 제 4장 고찰 및 결론 37
• 참고문헌 41
• Abstract 48