효모 Pichia pastoris에서 재조합 인간 유래 Epidermal Growth Factor(rhEGF) 단백질 고생산에 관한 연구 = High-level production of recombinant human-derived epidermal growth factor (rhEGF) in the yeast Pichia pastoris

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This study aimed to establish a secretory production process for recombinant human epidermal growth factor (rhEGF) in Pichia pastoris and to assess strains constructed with three promoters (AOX1, GAP, and ADH3). A 6His–4DK-tagged rhEGF expression cassette was cloned into pPICZαA, pGAPZαA, and pADH3ZαA and integrated into P. pastoris X-33. Candidate high-producing clones were obtained using liquid post-transformational vector amplification (LPTVA) followed by SDS-PAGE-based screening, and cultivated in 5 L DO-stat fed-batch fermentations. Cell growth, DO profiles, SDS-PAGE of culture supernatants, and BCA assays were used to characterize secretion. rhEGF was purified from harvest supernatants by Ni²⁺-affinity chromatography and quantified by BCA. The estimated rhEGF recovery per litre was approximately 210, 120, and 14 mg/L for AOX1-, ADH3-, and GAP-based strains, corresponding to total recoveries of about 490, 210, and 44 mg per run, respectively. Overall, all three promoters enabled secretory rhEGF production under the conditions tested; AOX1 showed the highest recovery, while ADH3 provided a methanol-free option with intermediate recovery.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 5
• 1. 사용 균주 및 발현 플라스미드 5
• 2. 배지 6
• 2.1 균주 배양 배지 6
• 3. rhEGF 발현 카세트 구축 및 형질전환 6
• 3.1 6His.4DK.hEGF 유전자 설계 및 준비 6
• 3.2 AOX1, GAP, ADH3 프로모터 기반 발현벡터 구축 7
• 3.3 P. pastoris X-33 형질전환 및 형질전환주 선발 8
• 4. LPTVA에 의한 고발현 균주 선별 9
• 5. 플라스크 배양 및 스크리닝 10
• 6. 5 L 발효 배지 및 피딩 용액 조성 11
• 6.1 발효에 사용한 생산 균주 11
• 6.2 Seed culture 조건 및 5 L 발효조 접종 11
• 6.3 5 L 발효 배지 조성 12
• 6.4 발효 조건 14
• 6.4.1 AOX1 발현 균주 14
• 6.4.2 ADH3 발현 균주 15
• 6.4.3 GAP 발현 균주 16
• 6.4.4 샘플링 및 반복 실험 17
• 7. 단백질 농도 측정(BCA assay) 17
• 8. SDS-PAGE 분석 18
• 9. rhEGF 정제(FPLC) 19
• 9.1 발효 상등액 전처리 19
• 9.2 Ni2+-친화 크로마토그래피(FPLC)를 이용한 rhEGF 정제 20
• Ⅲ. 결과 22
• 1. AOX1, GAP, ADH3 프로모터 기반 rhEGF 발현 균주의 구축 및 선발 22
• 1.1 AOX1 프로모터 기반 rhEGF 발현 균주 구축 및 선발 22
• 1.2 GAP 프로모터 기반 rhEGF 발현 균주 구축 및 선발 27
• 1.3 ADH3 프로모터 기반 rhEGF 발현 균주 구축 및 선발 34
• 2. 5 L 발효조에서의 rhEGF 생산 41
• 2.1 세 균주의 성장 곡선(OD600) 비교 41
• 2.2 DO profile을 통한 프로모터별 발효 운전 특성 43
• 2.3 발효 종료 상등액 SDS-PAGE에 의한 rhEGF 분비 발현 확인 45
• 2.4 BCA assay를 이용한 시간 경과별 단백질 생산성 비교 47
• 3. Ni²⁺-친화 크로마토그래피에 의한 rhEGF 정제 및 회수 수율 비교 48
• Ⅳ. 고찰 54
• 1. AOX1, GAP, ADH3 프로모터 기반 rhEGF 발현 특성 54
• 2. LPTVA를 이용한 고발현 균주 선별과 rhEGF 발현 양상 55
• 3. DO-stat 기반 5 L 발효에서의 프로모터별 공정 거동 57
• 4. 생산성 vs 공정 운전성 : 프로모터·탄소원의 선택 58
• Ⅴ. 결론 60
• Ⅵ. 참고문헌 62