변형 뉴클레오타이드 도입 mRNA 백신과 STING 작용제 CDN 의 합성 및 작용에 관한 연구 = Design, Synthesis and Mechanistic studies of Nucleotide-Modified mRNA Vaccines and STING-Agonist Cyclic Dinucleotide

국문 초록 (Abstract)

메신저 RNA(mRNA) 백신 기술은 질병 예방 및 면역 치료를 위한 빠르고 다재다능하며 매우 강력한 플랫폼을 제공함으로써 현대 백신학을 변화시켰습니다. 면역 치료의 맥락에서 고리형
다이뉴클레오타이드(CDN)는 종양과 감염원에 대한 선천적 및 적응적 면역 반응의 중심 조절자인 STING(인터페론 유전자 자극제) 경로의 강력한 작용제로서 중추적인 역할을 합니다. mRNA 와 CDN 의 화학적 변형은 안정성을 높이고 효소 분해에 대한 감수성을 줄이며 치료 효능과 안전성을 최적화하는 데 매우 중요합니다. 이 포괄적인 논문은 기계론적 연구를 위한 화학적으로 변형된
뉴클레오타이드와 고리형 디뉴클레오타이드(CDN)의 합리적인 설계와 합성을 제시합니다. 일련의 C(5)-할로겐화된 피리미딘 리보뉴클레오사이드 삼인산, 특히 시티딘과 우리딘 유사체가 합성되어 시험관 내 전사를 통해 mRNA 코딩 영역에 통합되었습니다. 전사 수율은 일반적으로 할로겐 크기가 증가함에 따라 감소했지만, C(5)- 아이오도 치환 변이체를 제외하고는 감소했습니다. 단일 부위 통합 중 C(5)-플루오로 및 클로로시티딘을 포함하는 mRNA 는 변형되지 않은 대조군에 비해 단백질 발현이 현저히 향상되었습니다. 특히, 시티딘 변형 mRNA 는 해당 우리딘 변형 mRNA 보다 번역 효율이 더 높았습니다. 또한, C(5)-플루오로시티딘과 슈도우리딘(ψ) 리보뉴클레오사이드 삼인산을 사용한 mRNA 의 이중 변형은 번역을 현저하게 향상시켜 단백질 발현을 최대 10 배까지 증가시켰습니다. 캡 의존적 번역과 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 의존적 번역을 비교 분석한 결과, 캡 의존적으로 변형된 mRNA 가 현저히 높은 단백질 출력을 나타냈습니다. 마지막으로 메틸, 벤질 및 파라-할로겐화 벤질 유도체를 포함하는 N7 및 N6-변형 고리형 다이뉴클레오타이드(3',3'-cGAMP) 유사체를 합성했습니다. 이러한 유사체는 시험관 내 분석을 통해 면역 세포에서 생물학적 활성을 검사했습니다. 변형된 유사체 중 N7, N6-디메틸 3', 3'-cGAMP, N7, N6-디벤질 3', 3'-cGAMP 및 N7-4-아이오도벤질 3'- cGAMP 유사체는 수정되지 않은 3',3'-cGAMP 에 비해 Ct 값이 감소함에 따라 IFN-α 유도가 향상된 것으로 나타났습니다. 그러나 IFNγ 발현은 N7-4-클로로벤질 3',3'-cGAMP 를 제외한 모든 유사체에서 상대적으로 변하지 않았으며, 이는 적응 면역 세포에서 제한된 TING 의존적 활성화를 나타냅니다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Messenger RNA (mRNA) vaccine technology has transformed modern vaccinology by providing a rapid, versatile and highly potent platform for disease prevention and immunotherapy. In the context of immunotherapy, cyclic dinucleotides (CDNs) play a pivotal role as potent agonists for the STING (Stimulator of Interferon Genes) pathway, which is a central regulator of both innate and adaptive immune responses against tumours and infectious agents. Chemical modification of both mRNA and cyclic dinucleotides plays a vital role in improving their stability, minimizing enzymatic degradation, and enhancing their therapeutic performance as well as safety profiles. This comprehensive thesis encompasses the rational design and chemical synthesis of modified nucleotides and cyclic dinucleotides (CDNs) aimed at mechanistic investigations. A series of pyrimidine ribonucleoside triphosphates halogenated at the C(5) position, particularly analogues of cytidine and uridine, were synthesized and subsequently incorporated into mRNA coding regions via in vitro transcription. Transcription efficiency generally decreased as the halogen substituent size increased, except for C(5)-iodo derivatives. Among single-site incorporations, mRNAs containing C(5)-fluoro- and C(5)-chloro-cytidine showed notably higher protein expression than unmodified mRNA controls. Notably, mRNA modified with cytidine demonstrated higher translation efficiency compared to its uridine-modified counterpart. Dual incorporation of C(5)-fluorocytidine and pseudouridine (Ψ) ribonucleoside triphosphates into mRNA markedly enhanced translation efficiency, resulting in up to a tenfold increase in protein production. Comparative analysis between cap-dependent and IRES-dependent translation showed that cap-dependent modified mRNAs produced substantially higher levels of protein expression. Finally, I synthesized N7 and N7 , N6 - Modified Cyclic Dinucleotide (3’,3’-cGAMP) analogues bearing methyl, benzyl and para–halogenated benzyl derivatives. These analogues were screening for their biological activity in immune cells via in vitro assays. Among the modified analogues, N7 , N6 -dimethyl 3’,3’-cGAMP, N7 , N6 - dibenzyl 3’,3’-cGAMP and N7 -4-Iodobenzyl 3’,3’-cGAMP analogues exhibited enhanced induction of IFN-α, as evidence by decrease Ct values compared to unmodified 3’,3’-cGAMP. However, IFN-γ expression remained relatively unchanged across all analogues except for N7 -4-Chlorobenzyl 3’,3’-cGAMP, indicating limited STING-dependent activation in adaptive immune cells.

목차 (Table of Contents)

• Chapter Ⅰ 1
• Chapter Ⅱ 10
• Chapter Ⅲ 40
• APPENDICES 63
• ABSTRACT (Korean) 117
• LIST OF PUBLICATIONS 119