SARS-CoV-2와 인플루엔자 A 바이러스 동시 방어를 위한 복제 결손 이중 백신의 개발 = Development of a Replication-Defective Bivalent Vaccine for Dual Protection Against SARS-CoV-2 and Influenza A Virus

국문 초록 (Abstract)

SARS-CoV-2와 인플루엔자 A 바이러스(IAV)의 동시 유행은 이른바 "트윈데믹(twindemic)"의 위험을 지속적으로 야기하고 있으며, 두 병원체를 단일 접종으로 동시에 방어할 수 있는 이중(bivalent) 백신의 필요성을 부각시키고 있다. 본 연구에서는 SARS-CoV-2의 뉴클레오캡시드(N) 유전자의 일부를 인플루엔자 A 바이러스의 보존적 뉴클레오프로테인(NP) 유전자로 치환한 복제 불능형(biologically containment) 이중 백신 후보 ANP-NC1S를 개발하였다. ANP-NC1S는 N 단백질을 발현하는 보완 세포주에서만 효율적으로 회수 및 증식되었으며, 일반 세포에서는 감염은 가능하지만 감염성 자손 바이러스를 생성하지 못하는 단일 주기(single-cycle) 감염 특성을 보여 우수한 안전성을 입증하였다. K18-hACE2 마우스에서 비강(intranasal) prime–boost 접종을 실시한 결과, ELISA를 통해 혈청 및 기관지폐포세척액(BALF)에서 SARS-CoV-2 스파이크(Spike) 특이 IgG 및 IgA 항체가 유의미하게 증가함을 확인하였다. ANP-NC1S는 복제 불능 백본인 N4S 및 PBS 대조군에 비해 유의미하게 높은 SARS-CoV-2 중화항체 역가(FRNT50)를 유도하였다. 또한 ELISPOT 분석을 통해 비장과 기관지폐포세척액에서 강력한 SARS-CoV-2 특이 IFN-γ 분비 T 세포 반응이 관찰되어 전신 및 점막 수준의 세포성 면역이 유도되었음을 확인하였다. 인플루엔자 NP 펩타이드 자극 시에는 ANP-NC1S 접종군에서 대조군 대비 NP 특이 T 세포 반응이 증가하는 경향을 보였다. 치사량(6 LD50)의 IAV PR8 공격 접종 모델에서 ANP-NC1S는 체중 감소를 유의미하게 억제하고 질병 중증도를 완화하였으며, 생존율 또한 증가하는 경향을 보였다. 이러한 결과는 ANP-NC1S가 SARS-CoV-2와 IAV에 대한 이중 면역 방어를 제공하는 안전한 복제 불능형 백신 후보임을 보여주며, N 결손 SARS-CoV-2 벡터가 차세대 다가 호흡기 백신 플랫폼으로 활용될 수 있는 가능성을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 13
• II. Materials and Methods 16
• 2.1 Cloning the cDNA of rSARS-CoV-2 mutant 16
• 2.2 Cell culture 18
• 2.3 N Expressing stable cell line (VeroE6-N-hTMPRSS2) 18
• 2.4 Flow cytometry analysis 20
• 2.5 Virus rescue and amplification 21
• 2.6 Growth kinetics 22
• 2.7 Plaque assay 22
• 2.8 Western blot 24
• 2.9 Reverse Transcription (RT)-PCR 26
• 2.10 Influenza A Virus Propagation and Harvest in Embryonated Chicken Eggs 26
• 2.11 HA assay 27
• 2.12 Mouse Immunization and Challenge assay 27
• 2.13 IFN-γ ELISPOT assay 28
• 2.14 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 30
• 2.15 Virus Neutralization Assay (FRNT50) 31
• III. Result 33
• 3.1 Generation of a Replication-Incompetent Bivalent SARS-CoV-2 Vector Expressing Influenza A Virus Nucleoprotein 33
• 3.1.1 Rational Design and Construction of the Recombinant cDNA 33
• 3.1.2 Rescue and Genotypic Validation of the Recombinant Virus 34
• 3.1.3 Phenotypic Characterization of ANP-NC1S In Vitro 36
• 3.2 Confirmation of Single-Cycle Infection Properties in Non-Complementing Cells 43
• 3.3 Induction of Robust Neutralizing Antibody Responses against SARS-CoV-2 by ANP-NC1S 47
• 3.4 Induction of SARS-CoV-2 and Influenza-Specific T Cell Responses in Systemic and Mucosal CompartmentsK18-hACE2 51
• 3.5 Protective Efficacy of ANP-NC1S against SARS-CoV-2 Challenge In Vivo 54
• 3.6 Protective Efficacy of ANP-NC1S against Heterologous Influenza Challenge In Vivo 58
• IV. Discussion 62
• Reference 65
• Acknowledgements 67