SARS-CoV-2 비구조단백질 1의 줄기-고리 8 결손에 의한 바이러스 유전자 발현 및 복제 약화 = Deletion of Stem-Loop 8 in SARS-CoV-2 Nonstructural Protein 1 Attenuates Viral Gene Expression and Replication

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

SARS-CoV-2 possesses a highly structured RNA genome in which cis-acting elements and nonstructural protein1 (nsp1) cooperate to control viral gene expression and host shut off. Although RNA hairpins in the 5’untranslated region have been studied extensively, the functional roles of RNA structures embedded within the nsp1 coding region remain poorly understood. Here, the contribution of a conserved stem-loop cluster (SL6-SL8) in the N-terminal portion of nsp1 was investigated using a 5’UTR-nsp1-mNeonGreen reporter and recombinant SARS-CoV-2 viruses. Deletion of individual stem-loops (∆SL6, ∆SL7, ∆SL8) or the entire SL6-SL8 cluster (∆SL678) reduced reporter RNA and protein expression in transfected HEK-293T cells and attenuated viral growth and plaque size in VeroE6 cells. RNA secondary structure prediction suggested that deletions in SL6 or SL8 induce extensive local refolding, whereas SL7 deletion has a more limited structural impact. Domain mapping of SL8 by in-frame internal deletions revealed that removal of only six nucleotides at the loop tip (∆SL8-1) decreased reporter output to approximately 40% of wild-type levels. And larger deletions (∆SL8-2, ∆SL8-3) nearly phenocopied complete SL8 removal. Corresponding SL8 internal deletion viruses exhibited impaired early reporter expression, lower peak of virus titers, and significantly smaller plaques. While Western blotting at 24 hours post infection showed reduced levels of nsp1, nsp12, and structural proteins compared to wild type. Despite these defects, extracellular and intracellular viral genomic RNA levels in SL6-SL8 and SL8 internal deletion viruses were largely preserved at later time points. Indicating that this module modulates the efficiency and timing of infectious virus production rather than bulk genome replication. These findings identify SL8 as a newly recognized, functionally critical within the nsp1 coding region and support a model in which the SL6-SL8 module promotes efficient viral RNA and protein expression and fine-tunes infectious virus output without abolishing genome replication.

국문 초록 (Abstract)

SARS-CoV-2는 5’ 말단에 위치한 구조적 RNA 와 비구조 단백질이 상호 작용하여 바이러스 유전자 발현과 숙주 shut off를 조절한다. 5’ 비번역 영역에 존재하는 RNA 헤어핀의 기능은 이미 많이 연구되어 왔으나, 비구조 단백질 1의 내부 RNA 구조체의 역할은 아직 명확히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 5’UTR-nsp1-mNeonGreen 리포터 및 역전사 유전학 기반 감염성 바이러스 시스템을 활용하여 비구조 단백질 1 영역의 보존된 줄기-고리의 기능을 연구하였다. 줄기-고리 6, 7, 8 각각 또는 전체를 제거하면 HEK-293T 세포 내 리포터 RNA 및 단백질 발현이 감소하고, VeroE6 세포에서 바이러스 성장률과 플라크의 크기가 모두 낮아졌다. RNA 이차 구조 예측 결과, 줄기-고리 6 또는 8 결손 시 비구조 단백질 1 구간의 국소 구조가 광범위하게 재배열되었고, 줄기-고리 7 결손은 상대적으로 제한적인 변화만 보였다. 줄기-고리 8 루프 부분을 부분적으로 제거한 것에서는 루프 부위 6개 뉴클레오타이드만 손실되었음에도 리포터 발현이 야생형의 약 40% 수준까지 감소했으며, 더 큰 내부 결손은 전체 줄기-고리 8 결손과 유사한 기능 저하를 보였다. 감염성 줄기-고리 8 결손 바이러스에서도 조기 리포터 발현 저하와 바이러스 농도 감소, 플라크 크기 감소가 관찰되었고, 감염 24시간 후 비구조 단백질 1, 12, 구조 단백질의 발현 역시 야생형보다 낮았다. 반면, 세포 내·외 바이러스 gRNA의 양은 특히 감염 후기 시점에서 야생형과 유사한 수준으로 회복되어, 이 모듈이 전체 게놈 복제량보다는 감염성 입자의 생성 효율과 시점을 주로 조절함을 시사한다. 이러한 결과는 비구조 단백질 1 구간 내 줄기-고리 8이 새로운, 기능적으로 중요한 RNA 구조체임을 제시하며, 줄기-고리 6-8 모듈이 특히 감염 초기에 바이러스 RNA 및 단백질 발현 효율을 지지하면서, 전체 게놈 복제를 유지한 채 감염성 바이러스 생성의 효율을 미세 조절하는 역할을 할 수 있음을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 10
• II. Materials and Methods 14
• 2.1 DNA constructs and Plasmid preparation 14
• 2.2 rSARS-CoV-2 mutant cDNA cloning 17
• 2.3 Cell Culture 19
• 2.4 Transfection 19
• 2.5 Virus Rescue and Infection 20
• 2.6 RT-PCR 21
• 2.7 Real-time PCR 22
• 2.8 Flow Cytometry 24
• 2.9 Viral Sample Collection for Growth Curve 26
• 2.10 Western Blot analysis 27
• 2.11 Virus Quantification by Focus Forming Assay (FFA) 32
• 2.12 Virus Quantification by Plaque Assay 34
• 2.13 Prediction of RNA structure 35
• 2.14 Statistical Analysis 35
• III. Result 36
• 3.1 Effects of SL6-SL8 deletions in the SARS-CoV-2 nonstructural protein 1 (nsp1) 36
• 3.2 Internal deletions within SL8 significantly reduce reporter RNA and protein expression 40
• 3.3 Growth kinetics and plaque size of SL6-SL8 deletion viruses in VeroE6 cells 44
• 3.4 SL6-SL8 deletions delay early infectious virus production but do not affect late-stage replication 49
• 3.5 Internal deletions within SL8 attenuate replication and plaque size in recombinant SARS-CoV-2 56
• 3.6 SL8 internal deletions show reduced early viral gRNA, reporter output, and protein expression 61
• IV. Discussion 68
• References 73
• Acknowledgements 74
• 국문 초록 75