CRISPR/Cas9 매개에 의한 청경채 및 배추 DUF679 막단백질 유전자(DMP)의 돌연변이 유도 = CRISPR/Cas9‑mediated mutagenesis of Pak-choi and Chinese cabbage DUF679 membrane protein (DMP) genes

국문 초록 (Abstract)

Pak-choi(Brassica rapa ssp. chinensis)의 전통적 육종은 동형접합의 형질을 가진 개체를 확보하기까지 여러 세대의 자가수분을 필요로 하며, 육종 효율 향상을 위해 많은 연구가 필요하다. 최근 여러 작물에서 DMP 유전자를 통한 반수체 유도가 보고되었으며, 해당 유전자의 유전자편집은 doubled haploid 생산체계 확립에 기여할 가능성이 있다. 본 연구에서는 Pak-choi의 BcDMP1A와 BcDMP2A를 분석하고 CRISPR/Cas9 기반의 유전자 편집을 시도하였다. 서열 분석 결과 두 유전자는 애기장대와 Brassica 계열에서 DUF679 domain과 transmembrane domain을 보존하고 있으며, 발현 분석에서는 BcDMP2A가 후기 꽃 발달 단계와 생식기관인 수술에서 강한 발현을 보인 반면, BcDMP1A는 매우 낮은 수준의 발현을 나타냈다. Subcellular localization pattern analysis 결과 두 단백질 모두 원형질막에 위치함이 확인되었다. 유전자편집을 위해 CRISPR/Cas9을 Agrobacterium을 통해 Pak-choi의 explant에 도입하였고, SAM과 Hypocotyl에서 재분화 된 개체를 확보하여 일부 개체에서 T-DNA 삽입을 확인하였다. 그러나 두 표적 유전자에서 Indel frequency 0%로 유전자 편집이 일어나지 않았음을 확인하였다. 동일한 벡터를 이용하여 동일한 실험방법으로 Chinese cabbage explant에도 도입한 결과, 차세대 염기서열 분석을 통해 BcDMP2A에서 indel이 발생하여 유전자 편집 개체를 확보하였다.

목차 (Table of Contents)

• Table of Contents i
• List of Figures iii
• List of Tables v
• ABSTRACT vii
• 1. Introduction 1
• 2. Materials and methods 4
• 2.1 Plant materials and growth conditions 4
• 2.2 Amino acid alignment and phylogenetic tree 5
• 2.3 Plasmid construction 6
• 2.3.1 Database searching and sequence alignment 6
• 2.3.2 Gene Cloning 6
• 2.4 Spatial Expression Analysis 7
• 2.4.1 RNA extraction and cDNA synthesis 7
• 2.4.2 Real-time quantitative PCR (RT-qPCR) analysis 9
• 2.5 Subcellular Localization Analysis 10
• 2.5.1 Protoplast Isolation 10
• 2.5.2 PEG-mediated protoplast transformation 11
• 2.6 CRISPR/Cas9 RNP transfections 12
• 2.6.1 Plant materials and Isolation of Pak- choi protoplasts 12
• 2.6.2 Design of sgRNA 13
• 2.6.3 PEG-mediated protoplast transfection 13
• 2.7. Explant transformation 15
• 2.7.1. Agrobacterium preparation 15
• 2.7.2 SAM explant transformation 17
• 2.7.3. Hypocotyl explant transformation 18
• 2.7.4. Hypocotyl Explant Transformation Using the EHA105 Ternary Vector System 20
• 2.7.5 Chinese cabbage explant transformation and gDNA extraction 21
• 2.7.6 T-DNA confirmation and targeted mutation analysis
• 21
• 3. Results 29
• 4. Discussion 59
• 5. References 62