The Pharmacological Effects of Ethyl Acetate Fraction of Amomum villosum var. xanthioides on Metabolic Dysfunction- Associated Steatohepatitis via Regulation of YAP/TAZ-SIRT6 Signaling Pathways = 사인의 에틸아세테이트 분획층이 자유유리지방산으로 유도된 대사성 간질환에 대한 간세포 보호 효능 및 YAP/TAZ-SIRT6 신호전달체계 조절 기전 연구

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 사인 (Amomum villosum var. xanthioides)의 ethyl acetate 분획(EFAX)이 FFA로 유도된 지방독성 환경에서 간세포를 보호하는 기전적 근거를 규명하고자 수행되었다. EFAX은 FFA로 유도된 Huh7 간세포의 지방독성(lipotoxicity)을 유의하게 완화하였다. EFAX 처리군에서 중성지방 축적 및 Oil Red O 염색 강도가 감소하였으며, 이는 EFAX가 간세포 내 지질대사를 조절함을 의미한다.
1. EFAX는 지방합성 관련 유전자인 SREBP1c, CHREBP1c, DGAT1/2, SCD1, PPARG의 발현을 억제하고, PPARA, CPT1A와 같은 β-산화 관련 유전자의 발현을 증가시켰다. 이를 통해 EFAX가 지방 축적을 억제하고 지방산 산화를 촉진하는 대사 항상성 조절 효능을 가짐을 확인하였다.
2. EFAX는 FFA 처리로 인해 증가한 ROS와 MDA 수준을 억제하고, GSH, SOD, Catalase 활성의 회복을 유도하였다. 이러한 결과는 EFAX가 산화적 스트레스를 감소시키고 항산화 방어체계를 강화함을 보여준다.
3. 분자기전적으로 EFAX는 FFA에 의해 활성화된 YAP/TAZ–TEAD 신호전달 경로를 억제하였고, 동시에 SIRT6의 전사 및 단백질 발현을 회복시켰다. 또한 히스톤 아세틸화 표지(H3K9Ac, H3K56Ac) 감소를 유도하여 EFAX가 후성유전(epigenetic) 수준에서 유전자 발현을 재조정함을 확인하였다.
4. Luciferase promoter assay 결과, EFAX는 SIRT6 프로모터 활성을 직접적으로 증가시켜, EFAX → ↓YAP/TAZ → ↑SIRT6 → ↓Histone acetylation → ↓Lipogenesis 경로가 작동함을 규명하였다.
5. 네트워크 약리학 및 KEGG 분석 결과, EFAX의 작용 표적은 PI3K-Akt, MAPK, AMPK, PPAR, TLR, JAK-STAT, Hippo(YAP/TAZ) 등 MASH 병태생리와 연관된 주요 경로에 다중적으로 관여하는 것으로 나타났다. 이러한 통합적 결과는 EFAX가 지질 대사 조절, 산화 스트레스 완화, YAP/TAZ–SIRT6 축 조절, 후성적 인자의 조절을 통해 MASH 병태생리를 다중 표적 수준에서 개선할 수 있음을 제시한다. 따라서 EFAX는 YAP/TAZ–SIRT6 축을 핵심 기전으로 하는 간세포 보호 및 항지방독성 천연물로서, 향후 대사성 간질환 치료제 후보물질로의 발전 가능성을 제시한다. 이에 아래와 같은 제언을 하고자 한다.
1. 본 연구는 in vitro 수준에서 EFAX의 분자기전을 규명하였으므로, 향후 in vivo MASH 동물모델에서의 효능 검증 및 약물동태(pharmacokinetics) 평가가 필요하다.
2. EFAX는 다성분 복합물로 구성되어 있으므로, 주요 활성성분(플라보노이드, 페놀류 등)을 분리·정제하여 각각의 기여도를 규명하는 성분 기반 약리학 연구가 요구된다.
3. YAP/TAZ 및 SIRT6의 인과관계를 확증하기 위해, 유전자 조작 모델(YAP/TAZ 과발현 및 SIRT6 knockdown/rescue)을 활용한 기능적 검증 실험이 필요하다.
4. EFAX의 용량–독성 관계 및 장기 안전성 평가를 통해, 임상 적용 가능한 치료범위(therapeutic window)를 명확히 설정할 필요가 있다.
5. 네트워크 약리학 분석 결과를 바탕으로 EFAX와 기존 항-MASH 약물(예: pioglitazone, obeticholic acid) 간의 병용투여 시너지 효과를 검증하는 연구가 향후 치료제 개발에 기여할 수 있을 것이다. EFAX의 YAP/TAZ–SIRT6 조절 기전은 간질환 외에도 심혈관, 신장, 신경 대사질환 등 다양한 조직의 대사성 질환에 적용 가능성이 있으므로, 적응증 확장 연구(translational research) 도 병행할 필요가 있다.

목차 (Table of Contents)

• Table of Contents ⅰ
• List of Tables ⅲ
• List of Figures ⅳ
• Ⅰ. Introduction 1
• Ⅱ. Materials and Methods 4
• 1. Preparation of EFAX 4
• 2. UHPLC–MS/MS Fingerprinting Analysis of EFAX 6
• 3. Cell culture 6
• 4. Cell viability assay 7
• 5. In vitro MASH model 8
• 6. Data acquisition and target preparation 9
• 7. KEGG pathway mapping and visualization 9
• 8. Assessment of oxidative stress 10
• 9. Antioxidant enzyme activity 11
• 10. Quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) 11
• 11. Immunofluorescence staining 13
• 12. Western blot analysis 13
• 13. Gene Promoter–Reporter Assay 16
• 14. Statistical analysis 16
• Ⅲ. Results 18
• 1. Chemical composition analysis in EFAX 18
• 2. Effects on Cell Proliferation 22
• 3. Pathological Target of MASH by Global overview of Mapped Signaling Nodes 25
• 4. KEGG Pathway Enrichment Analysis 27
• 5. Effects on lipid droplets and lipid profiling 29
• 6. EFAX attenuates FFA-induced lipogenic gene expression in the human hepatocyte cell line, Huh7 cells 33
• 7. EFAX suppresses cellular oxidative stress 43
• 8. EFAX enhances cellular antioxidant components 46
• 9. EFAX Attenuates FFA-Induced Activation of the YAP/TAZ–TEAD Signaling Pathway 50
• 10. EFAX Restores SIRT6 Expression as a Downstream Effector of YAP/TAZ Signaling 56
• 11. EFAX Enhances SIRT6 Promoter Activity via Transcriptional Regulation 59
• Ⅳ. Discussion 61
• Ⅴ. Conclusion 65
• References 67
• Abstract in Korean 75