Discovery of durumamide D as a novel ACSL4 inhibitor for radioresistant breast cancer

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Abstract
Background: Recent studies indicate that ACSL4, a long-chain acyl-CoA synthetase involved in the activation and metabolism of polyunsaturated fatty acids, is overexpressed in diverse malignancies and promotes cancer progression. Although ACSL4 has recently emerged as a promising therapeutic target, only a few ACSL4 inhibitors have been developed, and their potential in overcoming radioresistance remains largely unexplored.
Purpose: This study aimed to discover compounds targeting ACSL4 and to elucidate their mechanisms of action in radioresistant breast cancer cells.
Methods: Cytotoxicity was evaluated using the Sulforhodamine B (SRB) assay. ACS activity was measured with a kit from Abcam company. Direct binding of the compound to ACSL4 was assessed by drug affinity responsive target stabilization (DARTS) and molecular docking simulations predicted its binding sites on ACSL4. Protein expression levels were determined by western blot analysis. The in vivo anti-tumor efficacy of the compound was evaluated following intraperitoneal (IP) and oral administration.
Results: Durumamide D exhibited the most selective cytotoxicity against radioresistant breast cancer cells among the tested compounds. It inhibited ACS activity and downregulated ACSL4 expressions in radioresistant cell lines. DARTS revealed direct binding of durumamide D to ACSL4, and molecular docking simulations further predicted its interation with AMP-binding domain of ACSL4. Mechanistically, its inhibitory effect on ACSL4 suppressed DNA damage response, thereby inducing apoptosis in radioresistant breast cancer cells. Consistent with in vitro findings, IP administration of durumamide D (20mg/kg) reduced tumor size by 50%. Importantly, oral administration exhibited approximately half the bioavailability of IP delivery, with 40mg/kg orally achieving tumor inhibition comparable to the 20mg/kg IP dose.
Conclusion: Taken together, durumamide D directly targets ACSL4 by binding to its AMP-binding domain, leading to selective cytotoxicity in radioresistant breast cancer cells. These findings suggest that durumamide D is a promising therapeutic candidate for developing ACSL4 inhibitors to overcome radioresistant breast cancer.

국문 초록 (Abstract)

배경: 장쇄 아실-CoA 합성효소(long-chain acyl-CoA synthetase)인 ACSL4는 다중불포화지방산(polyunsaturated fatty acids)의 활성화와 대사에 관여한다. 최근연구에 따르면, 다양한 암에서 ACSL4의 발현이 높게 나타나며, 환자의 나쁜 예후와 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. 따라서 ACSL4가 최근 새로운 치료 표적으로 주목받고 있으나, 현재까지 개발된 ACSL4 표적억제제는 소수에 불과하며, 방사선 내성암에 대한 치료효과 연구는 전무한 실정이다.
목적: 본 연구는 ACSL4를 표적으로 하는 화합물을 개발하고, 이들의 작용 기전을 방사선 내성 유방암 세포에서 규명하는 것을 목표로 하였다.
방법: 세포독성은 Sulforhodamine B(SRB) 분석을 통해 평가하였으며, ACS 활성 억제 효과는 Abcam사의 키트를 사용하여 측정하였다. 화합물의 ACSL4에 대한 결합은 Drug Affinity Responsive Target Stabilization (DARTS)와 molecular docking simulation을 통해 평가하였다. 단백질 발현 수준은 western blot 분석으로 확인하였으며, 화합물의 항종양 효능은 복강 내(IP) 및 경구 투여를 통해 in vivo에서 평가하였다.
결과: Durumamide D는 세포독성을 평가한 화합물 중 방사선 내성 유방암 세포에 대해 가장 선택적인 세포독성 효과를 나타냈다. Durumamide D는 방사선 내성 세포주에서 ACS 활성을 효과적으로 억제하였고 ACSL4 발현을 감소시켰다. DARTS 분석을 통해 durumamide D가 ACSL4에 직접 결합함을 규명하였으며, molecular docking simulation을 통해 durumamide D가 ACSL4의 AMP binding domain과 결합함을 예측하였다. 기전 분석 결과, durumamide D의 ACSL4 억제 효과는 DNA 손상 반응을 억제하여 방사선 내성 유방암 세포에서 세포자멸사를 유도함을 보여주었다. 방사선 내성 유방암동물실험에서, 20mg/kg의 durumamide D를 복강내(IP)로 투여한 결과 종양 성장이 50% 감소하였으며, 40mg/kg을 경구 투여하였을 때 IP 20mg/kg과 유사한 종양 억제 효과를 나타내어, 경구투여가 IP 투여의 약 절반 수준의 생체이용률을 보였음을 확인하였다.
결론: 요약하면, durumamide D는 ACSL4의 AMP binding domain에 직접 결합하여 방사선 저항성 유방암 세포에서 선택적인 세포독성을 나타낸다. 이러한 결과는 durumamide D가 방사선 저항성 유방암 치료를 위한 새로운 ACSL4 표적억제제로서 개발될 가능성이 있음을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• I. INTRODUCTION 1
• II. MATERIALS AND METHODS 3
• Cell Culture 3
• Establishment of radioresistant cell lines 3
• Cell viability assay 4
• Acyl-CoA Synthetase Activity Assay 4
• Drug Affinity Responsive Target Stabilization (DARTS) Assay 5
• Molecular Docking Studies 5
• Western Blot Analysis 6
• In vivo studies 7
• Statistical analysis 8
• III. RESULTS 9
• Durumamide D exhibited the most potent cytotoxicity against radioresistant breast cancer cells 9
• Durumamide D inhibited ACS enzymatic activity and ACSL4 expression 13
• Durumamide D directly targeted ACSL4 15
• Durumamide D bound to AMP-binding site of ACSL4 17
• Durumamide D induced apoptosis by suppressing DNA damage response 19
• Durumamide D inhibited tumor growth in radioresitant tumor-bearing mice 23
• IV. DISCUSSION 26
• V. CONCLUSION 29
• REFERENCES 30
• ABSTRACT 35
• ABSTRACT (Korean version) 37