극지 환경에서 발굴한 에스터레이즈와 향상된 촉매 활성을 가진 돌연변이 효소의 특성 연구

국문 초록 (Abstract)

에스터레이즈는 에스테르 결합을 가수분해하는 효소로, 식품, 제약, 세제, 바이오 촉매 등 다양한 산업 분야에서 널리 활용된다. 본 연구에서는 남극 유래 미생물 7종으로부터 샷건 클로닝을 통해 새로운 에스터레이즈 유전자를 찾고, 이 유전자로부터 만들어지는 효소단백질을 EstPN8으로 명명하였다. EstPN8은 223개의 아미노산으로 구성된 약 25 kDa 단백질로, 보존 서열 GXSXG motif와 촉매 삼합체 Ser121–Asp173–His204를 가지는 α/β-hydrolase 패밀리 IV에 속하는 것으로 확인되었다. EstPN8의 생화학적 특성 분석 결과, 최적 반응 조건은 40-50℃, pH 7.0–9.0이었으며, 여러길이의 지방산 에스테르 중에서 p-nitrophenyl hexanoate (C6)에 대해 가장 높은 활성을 나타냈다. C6에 대한 Specific activity 는 1.99 U/mg이었다. E. coli 균에서 EstPN8이 수용성 형태로 대량 발현되는 것이 확인되었지만, 예상과 달리 활성이 높지 않은 것으로 밝혀졌기 때문에 error-prone PCR과 site-directed mutagenesis를 통해 활성 부위 주변 아미노산을 변이시켰다. 그 결과, 최종적으로 네 가지 변이를 결합한 F1 변이체 (D35A, M142L, P174D, Q205F)는 wild-type 대비 약 4.1배 높은 활성을 보였다. 이는 구조적 유연성과 기질 결합 환경 조절이 효소 반응성 향상에 핵심적인 역할을 함을 시사한다. 결론적으로, 본 연구는 남극 미생물 유래 EstPN8이 중온·알칼리성 조건에서 안정한 활성을 유지하며, 분자진화 기법을 통해 촉매 효율을 크게 개선할 수 있음을 입증하였다. 이러한 결과는 EstPN8 및 변이체들이 생분해성 고분자 분해, 유기합성, 바이오촉매 반응 등 다양한 생명공학 및 산업에 응용에 활용될 수 있음을 보여주며, 극지 미생물 유래 신규 효소의 다양성을 확장하고 효소공학적 활용 가능성을 제시하는데 기여할 것으로 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• 표 목 차 iv
• 그 림 목 차 v
• 초 록 viii
• 1. 서론 1
• 2. 실험 재료 및 방법 3
• 2.1. 재료 3
• 2.2. 유전자 클로닝 4
• 2.3. 염기 서열 및 단백질 3차원 구조 분석 8
• 2.4. E.coli 에서의 EstPN8 발현 8
• 2.5. 단백질 정제 12
• 2.6. 효소의 활성 측정 12
• 2.7. 효소의 재접힘 13
• 2.8. 효소의 온도, pH 그리고 기질에 대한 특성 13
• 2.9. 효소의 염과 금속이온에 대한 특성 14
• 2.10. 랜덤 PCR 돌연변이 15
• 2.11. 위치 지정 돌연변이 16
• 2.12. 3D 구조 모델링 16
• 2.13. 겔 투과 크로마토그래피 17
• 2.14. EstPN8의 동력학적 특성 17
• 3. 결과 및 고찰 19
• 3.1. 극지 미생물로부터의 지방분해 효소 유전자 스크리닝 및 클로닝 19
• 3.2. EstPN8의 서열 분석, 계통수 구축 및 구조 모델링 21
• 3.3. EstPN8의 발현 및 정제 27
• 3.4. EstPN8의 재접힘 29
• 3.5. EstPN8의 효소학적 특성 분석 31
• 3.6. EstPN8의 최적 반응 조건 분석 37
• 3.7. 1차 돌연변이 유도 40
• (1) 1차 랜덤 PCR 돌연변이 유도 및 스크리닝, 상대 활성 측정 40
• (2) 1차 위치 지정 돌연변이 유도, 상대 활성 측정 41
• (3) His-tag 부착 유무 효소 활성 분석 42
• 3.8. A2 주형의 2차 돌연변이 유도 43
• (1) 2차 랜덤 PCR 돌연변이 유도 및 스크리닝, 상대활성 측정 43
• (2) 2차 위치 지정 돌연변이 유도, 상대 활성 측정 43
• (3) 돌연변이 결합, 상대 활성 측정 44
• 3.9. D1 주형의 3차 돌연변이 유도 45
• 3.10. 돌연변이 효소의 구조 비교 분석 48
• 3.11. 돌연변이 효소의 이량체 구조 비교 분석 53
• 3.12. 돌연변이 F1 효소의 특성 60
• 결 론 64
• 참고문헌 66
• 영문 논문제출서 76
• 영문인준서 77
• 영문 초록 (ABSTRACT) 78