Engineering Antibody-Polymer Conjugates for Inflammatory Disease Therapy

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are clinically validated across diverse diseases; however, their performance can diminish under physicochemical stress during storage and administration. To address this limitation, this thesis examines polymer conjugation as a strategy to enhance both structural stability and biological functionality of mAbs, focusing on two clinically established polymers, polyethylene glycol (PEG) and poloxamer (PX). In Chapter 2, the study focused on adalimumab (ADA), a tumor necrosis factor-α (TNF-α) neutralizing antibody widely used for autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis. ADA was conjugated with PEG or PX and systematically evaluated through structural integrity and stability assessments, binding kinetics, and biological assays. Among the evaluated parameters, polymer conjugation markedly enhanced resistance to thermal, denaturant, proteolytic, and biological fluid stresses, thereby improving overall stability and durability. The ADA– PX conjugate exhibited superior structural stability and physicochemical XVIII resilience while maintaining antigen-binding integrity. In contrast, the ADA–PEG conjugate achieved comparable stabilization but showed a modest decline in binding affinity. In vivo studies further demonstrated that both polymer conjugates prolonged therapeutic efficacy compared with the native antibody, with the PX conjugate producing a more sustained suppression of joint inflammation and tissue damage in the rheumatoid arthritis model. Chapter 3 expanded the application of PX conjugation as a platform across antibodies with distinct therapeutic mechanisms, including bevacizumab (BEV, anti-VEGF), cetuximab (CET, anti-EGFR), and atezolizumab (ATZ, anti-PD-L1). Each PX conjugate maintained native structural integrity while improving resistance to environmental stresses (e.g., vitreous humor or human plasma incubation) and enhanced antibody-specific functional outcomes: BEV–PX effectively inhibited endothelial migration, CET–PX promoted EGFR-dependent cell-cycle arrest, and ATZ–PX enhanced T-cell activation in tumor cell and immune cell co-culture system. Collectively, the results suggest that polymer conjugation may consistently improve structural stability across diverse antibodies, while PX could provide more effective functional retention than PEG, potentially influenced by factors such as epitope topology, site accessibility, and interfacial behavior. Overall, this thesis positions PX conjugation as a practical and versatile platform that enhances antibody performance without compromising structural integrity, complementing PEGylation in stability enhancement and achieving superior functional retention across multiple therapeutic applications. These findings support the further development of antibody–poloxamer conjugates as Biobetter candidates and provide a rationale for future quantitative binding analysis, and in vivo pharmacological studies to optimize antibody-poloxamer conjugation for next generation biologics.

국문 초록 (Abstract)

치료용 단일클론항체는 다양한 질환에서 임상적으로 검증된 치료제이지만, 보관 및 투여 과정 중 물리·화학적 스트레스에 의해 구조적 안정성과 효능이 저하되는 한계를 가진다. 본 학위논문에서는 이러한 한계를 극복하기 위한 방안으로, 항체의 구조적 안정성 및 물리화학적 안정성과 생물학적 기능을 동시에 향상시키기 위한 고분자 접합(polymer conjugation) 전략을 제시하였다. 이를 위해 임상적으로 널리 사용되는 두 가지 고분자인 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG)과 폴록사머(Poloxamer, PX)를 중심으로 연구를 수행하였다.
2장에서는 자가면역질환 치료에 널리 활용되는 종양괴사인자-알파(TNF-α) 중화 항체인 아달리무맙(Adalimumab)을 대상으로 PEG 및 PX 접합체를 합성하고, 구조적 무결성과 안정성 평가, 결합 동역학 분석, 생물학적 활성을 종합적으로 검증하였다. 그 결과, 고분자 접합은 열, 변성제, 단백질분해 효소, 생체 유체 등의 다양한 스트레스 조건에서 항체의 저항성을 현저히 향상시켜 전체적인 안정성과 내구성을 높였다. 특히 PX 접합체는 항체의 항원 결합 구조를 유지하면서도 우수한 구조적 안정성과 물리·화학적 내성을 보였으며, PEG 접합체는 안정성이 향상되었음에도 결합 친화도가 소폭 감소하는 경향을 나타냈다. 동물실험 결과, 두 종류의 고분자 접합체 모두 기존 항체에 비해 치료 효능의 지속성이 향상되었으며, 특히 PX 접합체는 류머티즘 관절염 모델에서 관절 염증과 조직 손상을 보다 효과적으로 억제하는 결과를 보였다.
3장에서는 폴록사머 접합 전략을 서로 다른 작용 기전을 갖는 항체로 확장하여, 항혈관신생 억제 항체인 베바시주맙(Bevacizumab), 상피세포성장인자수용체(EGFR) 차단 항체인 세툭시맙(Cetuximab), 그리고 면역관문억제 항체인 아테졸리주맙(Atezolizumab)을 대상으로 플랫폼 수준의 적용 가능성을 검증하였다. 각 폴록사머 접합체는 항체의 구조적 무결성을 유지하면서도, 방수(vitreous humor) 및 인간 혈장(human plasma) 등 다양한 환경적 스트레스 조건에서 안정성이 향상되었으며, 항체의 생물학적 기능 또한 기전 특성에 따라 보존되거나 강화되었다. 폴록사머 접합은 베바시주맙의 항혈관신생 효과를 증대시켰고, 세툭시맙의 EGF 의존적 증식 억제 능력을 향상시켰으며, 아테졸리주맙에서는 PD-1/PD-L1 억제 기능을 안정적으로 유지하여 T세포의 활성을 유지하였다.
이상의 결과를 종합하면, 고분자 접합은 다양한 항체에서 구조적 안정성을 일관되게 향상시키며, 특히 폴록사머 접합체는 폴리에틸렌글리콜 접합체보다 항체의 기능적 활성을 보다 효과적으로 보존하는 경향을 나타냈다. 이러한 차이는 항원결정기 구조(epitope topology), 접합 부위 접근성(site accessibility), 그리고 계면 거동(interfacial behavior)과 같은 분자적 요인에 의해 영향을 받을 가능성이 있다. 본 연구는 폴록사머 접합이 항체의 구조적 무결성을 유지하면서 성능을 향상시킬 수 있는 실용적이고 다기능적인 플랫폼으로 작용할 수 있음을 제시하였다. 또한 폴리에틸렌글리콜 기반 안정화 효과를 보완하면서 다양한 치료 응용 분야에서 우수한 기능적 보존성을 달성할 수 있음을 확인하였다. 본 연구의 결과는 향후 항체–폴록사머 접합체의 개발 확대를 위한 근거를 제공하며, 정량적 결합 분석 및 생체 내 치료 효능 연구를 통해 차세대 항체 의약품 개발에 기여할 것으로 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• 목차 I
• List of Table IX
• List of Figures X
• Abstract XVII
• Chapter 1. Introduction 1
• 1.1. Antibody Therapeutics 2
• 1.2. Biomedical Application of Polymer 5
• 1.3. Biobetters : Beyond Biologics 9
• 1.4. References 13
• Chapter 2. Adalimumab-Poloxamer Conjugates for Bio-better: Enhanced Stability and Function 21
• 2.1. Abstract 22
• 2.2. Introduction 24
• 2.3. Materials and methods 29
• 2.3.1. Materials 29
• 2.3.2. Polymer modification 30
• 2.3.3. Synthesis and characterization of adalimumab-polymer conjugates 31
• 2.3.4. Size-exclusion chromatography profiles of adalimumab-polymer conjugates 32
• 2.3.5. Optical analysis of antibody primary & secondary structure 33
• 2.3.6. Calculation melting point of adalimumab-polymer conjugates 34
• 2.3.7. Thermal stability assessment 35
• 2.3.8. Proteolytic stability assessment 35
• 2.3.9. Denaturant stability assessment 36
• 2.3.10. Stability assessment against biological condition 36
• 2.3.11. Competitive TNF-αbinding assay 37
• 2.3.12. Quantitative affinity kinetics measurement 38
• 2.3.13. Cell culture and incubation conditions 39
• 2.3.14. Cell viability test 39
• 2.3.15. In vitro TNF-α neutralization ability test 39
• 2.3.16. Animals and rheumatoid arthritis model 41
• 2.3.17. In vivo therapeutic effect analysis by clinical assessment 41
• 2.3.18. Blood analysis for pro-inflammatory cytokines and biochemistry 42
• 2.3.19. In vivo radiologic and histopathological assessments 43
• 2.3.20. Pharmacokinetics study 44
• 2.3.21. Statistical analysis 44
• 2.4. Results and discussion 46
• 2.4.1. Synthesis and characterization of Adalimumab-polymer conjugates 46
• 2.4.2. Stability of Adalimumab-polymer conjugates in diverse physicochemical conditions 64
• 2.4.3. Polymer-driven alteration of antigen binding kinetics of adalimumab-polymer conjugates 69
• 2.4.4. Cytotoxicity and TNF-α neutralization efficacy of adalimumab-polymer conjugates 73
• 2.4.5. In vivo therapeutic efficacy of adalimumab-polymer conjugates in rheumatoid arthritis mouse model 78
• 2.4.6. Histopathological Validation of In vivo Adalimumab-polymer conjugates therapeutic efficacy 84
• 2.4.7. Pharmacokinetics study of polymer conjugation effects on Adalimumab 89
• 2.4.8. In vivo biosafety of Adalimumab-polymer conjugates 93
• 2.5. Conclusion 96
• 2.6. References 98
• Chapter 3. Toward a Platform Strategy: Poloxamer Conjugation Across Various Therapeutic Antibodies 108
• 3.1. Abstract 109
• 3.2. Introduction 111
• 3.3. Materials and methods 116
• 3.3.1. Materials 116
• 3.3.2. Synthesis of each antibody-polymer conjugates 117
• 3.3.3. Characterization of antibody-polymer conjugates 118
• 3.3.4. Structural integrity of antibody-polymer conjugates . 119
• 3.3.5. Thermal stability of antibody-polymer conjugates 120
• 3.3.6. Denaturant stability of antibody-polymer conjugates 121
• 3.3.7. Proteolytic stability of antibody-polymer conjugates 121
• 3.3.8. Biofluidic stability of antibody-polymer conjugates 122
• 3.3.9. Cell culture 124
• 3.3.10. Cytotoxicity assay 125
• 3.3.11. In vitro cellular anti-angiogenesis assessment 125
• 3.3.12. In vitro EGFR-mediated proliferation assessment 126
• 3.3.13. In vitro T cell and cancer cell interaction analysis 127
• 3.4. Results and discussion 130
• 3.4.1. Synthesis of each antibody-polymer conjugates 130
• 3.4.2. Characterization of polymer conjugation and optical analysis of antibody primary & secondary structure 136
• 3.4.3. Evaluation stability of antibody-polymer conjugates under various stress 139
• 3.4.4. In vitro functional validation of antibody-polymer conjugates at the cellular level 150
• 3.5. Conclusion 163
• 3.6. References 168
• 국문 논문제출서 174
• 국문 인준서 175
• 국문 초록 176