Oncogenic roles of PRAME and its stabilization in cutaneous melanoma

국문 초록 (Abstract)

악성 피부 흑색종은 멜라닌세포 기원의 공격적인 암으로, 피부암 관련 사망의 주요 원인이다. 표적 치료제에 대한 빈번한 내성은 환자 생존율 향상을 제한하며, 효과적인 치료 전략 개발을 위해 근본적인 분자 기전의 규명이 필수적이다. PRAME (Preferentially expressed antigen in melanoma)은 잠재적인 흑색종 바이오마커로 확인되었으며 불량한 예후와 연관되어, 진단 및 치료 표적으로서의 가능성을 시사한다. 그러나 흑색종 진행에서 PRAME의 역할은 불명확하다. 본 학위논문은 PRAME의 종양 촉진 기능을 규명하고 단백질 안정성을 조절하는 기전을 연구하는 것을 목적으로 하였다.
예비 관찰에서, 흑색종 환자의 전사체 분석을 통해 PRAME 발현이 원발성 및 전이성 흑색종 모두에서 증가되어 있음을 확인하였으며, PRAME이 흑색종 세포의 증식과 생존에 필수적임을 밝혔다. PRAME 고갈 후 수행한 전사체 분석에서는 p53 활성화, 성장 억제, 일차 섬모 유도를 포함한 종양 억제 경로의 활성화가 확인되었다. 이러한 관찰을 바탕으로 흑색종 진행에서 PRAME의 기능적 역할을 연구하였다.
첫 번째 연구에서는 PRAME에 의한 p53 불활성화를 조사하였다. p53 돌연변이는 많은 인체 암에서 빈번하지만, 흑색종은 상대적으로 낮은 돌연변이율을 보인다. 그러나 이러한 낮은 돌연변이율에도 불구하고 흑색종에서 p53 기능은 종종 억제되어 있다. 이는 다른 기전에 의한 p53의 기능적 불활성화를 시사한다. PRAME 고갈은 p53 경로를 활성화시키고 p53 아세틸화를 증가시켰다. 기전적으로, PRAME은 p53 탈아세틸화효소 SIRT1의 음성 조절자인 DBC1과 상호작용하였다. PRAME과 SIRT1의 병용 억제는 흑색종 종양 성장 억제를 강화하였다. 이러한 결과는 PRAME이 SIRT1-DBC1 축을 통해 p53을 불활성화시킴으로써 흑색종 성장을 촉진함을 나타냈다.
두 번째 연구에서는 PRAME에 의한 p21의 전사 억제를 조사하였다. 종양억제인자 p21은 p53 표적 유전자 중 하나이다. DNA 손상에 의한 p53 활성화 시, PRAME 양성 흑색종 세포에서 p21 유도는 다른 p53 표적 유전자(BTG2, TP53INP1)에 비해 지연되어 있었다. 또한, 흑색종 환자에서 PRAME과 p21 발현은 음의 상관관계를 보였다. ChIP-seq 분석을 통해 PRAME과 TFAP2A가 p21 프로모터에 동원됨을 확인하였다. 나아가, PRAME과 TFAP2A는 HDAC1과 삼자 복합체를 형성하여 p21 프로모터 활성을 억제하였다. 이러한 결과는 PRAME이 TFAP2A와 협력하여 p21 전사를 억제함으로써 흑색종 진행에 기여함을 시사하였다.
세 번째 연구에서는 PRAME에 의한 일차 섬모 형성 억제를 탐구하였다. 일차 섬모의 소실은 흑색종을 포함한 종양 발생의 특징적인 현상이다. PRAME 발현은 흑색종에서 일차 섬모 형성과 음의 상관관계를 보였다. 기능 연구를 통해 PRAME이 흑색종 세포에서 일차 섬모 형성을 억제함을 확인하였다. 이와 일관되게, RNA-seq 및 ChIP-seq 분석에서 PRAME이 섬모 형성과 유지에 필수적인 IFT 유전자들의 발현을 억제함을 밝혔다. 모티프 분석을 통해 ETS2가 추가적인 전사인자로 확인되었다. PRAME과 ETS2는 전사 억제를 위해 HDAC1을 IFT 유전자 프로모터에 동원하였다. 이러한 결과는 PRAME이 IFT 유전자를 후성유전적으로 억제하여 일차 섬모 형성을 저해함으로써 종양 발생을 촉진함을 제시하였다.
네 번째 연구에서는 PRAME 단백질 안정성의 조절 기전을 연구하였다. PRAME 단백질은 흑색종에서 지속적으로 증가되어 있으나, 그 안정성을 조절하는 기전은 불명확하였다. In silico 스크리닝을 통해 탈유비퀴틴화효소 BAP1을 잠재적인 PRAME 조절자로 확인하였다. PRAME 안정성은 BAP1의 촉매 활성에 의존하였다. 흑색종 이종이식 모델에서 BAP1 고갈은 PRAME 단백질 수준을 감소시키고 종양 성장을 억제하였다. 임상적으로, BAP1과 PRAME의 동시 고발현은 불량한 예후와 연관되었다. 이러한 결과는 PRAME이 BAP1에 의한 안정화를 통해 흑색종 진행에서의 역할을 유지함을 나타냈다.
요약하면, 본 학위논문은 PRAME이 p53 불활성화, p21 억제, 섬모 형성 저해를 통해 종양 억제 경로를 차단함으로써 흑색종 진행을 촉진함을 입증하였다. 나아가, BAP1을 PRAME 안정화인자로 확인함으로써 이러한 종양 촉진 기능을 억제하기 위한 상위 표적을 제시하였다. 이러한 결과들은 PRAME과 그 조절 기전을 표적으로 하는 것이 흑색종 치료를 위한 잠재적 치료 전략임을 시사한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Malignant cutaneous melanoma is an aggressive cancer of melanocytic origin and remains the leading cause of skin cancer mortality. Frequent resistance to targeted therapies limits improvements in patient survival, making elucidation of the underlying molecular mechanisms essential for developing effective therapeutic strategies. PRAME (Preferentially expressed antigen in melanoma) has been identified as a potential melanoma biomarker and is associated with poor prognosis, suggesting both diagnostic and therapeutic potential. However, the role of PRAME in melanoma progression remains unclear. This dissertation aimed to elucidate the oncogenic functions of PRAME and investigate the mechanisms regulating its protein stability.
In preliminary observations, transcriptomic analyses of melanoma patients demonstrated that PRAME expression was elevated in both primary and metastatic melanomas, and PRAME was essential for melanoma cell proliferation and survival. Subsequent transcriptomic analyses following PRAME depletion revealed activation of tumor-suppressive pathways, including p53 activation, growth inhibition, and induction of primary cilia. Based on these observations, the functional roles of PRAME in melanoma progression were investigated.
In the first study, p53 inactivation by PRAME was examined. Although p53 mutations are frequent in many human cancers, melanoma exhibits a relatively low mutation rate. However, p53 function is often suppressed in melanoma despite this low mutation rate, suggesting functional inactivation by alternative mechanisms. PRAME depletion activated the p53 pathway and increased p53 acetylation. Mechanistically, PRAME interacted with DBC1, a negative regulator of the p53 deacetylase SIRT1. Combined inhibition of PRAME and SIRT1 enhanced suppression of melanoma tumor growth. These findings suggested that PRAME promotes melanoma growth by inactivating p53 through the SIRT1-DBC1 axis.
In the second study, transcriptional repression of p21 by PRAME was investigated. The tumor suppressor p21 is one of the p53 target genes. Upon DNA damage-induced p53 activation, p21 induction was attenuated compared with other p53 target genes (BTG2 and TP53INP1) in PRAME-positive melanoma cells. Moreover, PRAME and p21 expression showed a negative correlation in melanoma patients. ChIP-seq revealed that PRAME and TFAP2A were recruited to the p21 promoter. Furthermore, PRAME and TFAP2A suppressed p21 promoter activity through formation of a ternary complex with HDAC1. These results suggested that PRAME cooperates with TFAP2A to repress p21 transcription, thereby contributing to melanoma progression.
In the third study, inhibition of primary cilia formation by PRAME was explored. Loss of primary cilia is a characteristic feature of tumorigenesis in various cancers, including melanoma. PRAME expression was negatively correlated with primary cilia formation in melanoma. Functional studies confirmed that PRAME suppressed primary cilia formation in melanoma cells. Consistently, RNA-seq and ChIP-seq revealed that PRAME suppressed the expression of IFT genes, which are critical for cilia formation and maintenance. Motif analysis identified ETS2 as an additional transcription factor. PRAME and ETS2 recruited HDAC1 to IFT gene promoters for transcriptional silencing. These findings suggested that PRAME promotes tumorigenesis by epigenetically repressing IFT genes to inhibit primary cilia formation.
In the fourth study, regulation of PRAME protein stability was investigated. Although PRAME protein is consistently elevated in melanoma, the mechanism regulating its stability remains unclear. In silico screening identified the deubiquitinase BAP1 as a potential PRAME regulator. PRAME stability depended on BAP1 catalytic activity. In melanoma xenograft models, BAP1 depletion reduced PRAME protein levels and suppressed tumor growth. Clinically, combined high expression of BAP1 and PRAME was associated with poor prognosis. These findings suggested that BAP1-mediated stabilization of PRAME sustains its oncogenic role in melanoma progression.
In summary, this dissertation demonstrates that PRAME drives melanoma progression by suppressing tumor-suppressive pathways through p53 inactivation, p21 silencing, and inhibition of cilia formation. Furthermore, identification of BAP1 as a PRAME stabilizer provides an upstream target for inhibiting these oncogenic functions. These findings suggest that targeting PRAME and its regulatory mechanisms represents a potential therapeutic strategy for melanoma treatment.

목차 (Table of Contents)

• List of Contents
• Abstract 1
• 1. General introduction
• 1.1 Malignant cutaneous melanoma 5
• 1.1.1 Clinical and molecular characteristics of melanoma 5
• 1.1.2 Functional inactivation of p53 in melanoma 9
• 1.1.3 Transcriptional dysregulation of p21 in melanoma 11
• 1.1.4 Defective primary cilia formation in melanoma 13
• 1.1.5 Elevated deubiquitinase BAP1 expression in melanoma 16
• 1.2 Preferentially expressed antigen in melanoma (PRAME) 18
• 1.2.1 PRAME as a potential biomarker in melanoma 18
• 1.2.2 Molecular functions of PRAME in malignancies 20
• 1.2.3 Regulation of PRAME expression and stability 23
• 1.3 Research objectives 25
• 2. Materials and methods
• 2.1 Cell lines and cell culture 26
• 2.2 Reagents and antibodies 26
• 2.3 Plasmids, site-directed mutagenesis and transfection 28
• 2.4 Lentivirus production and stable cell line generation 29
• 2.5 Western blotting (WB) 29
• 2.6 Immunoprecipitation (IP) 30
• 2.7 Recombinant protein purification and GST pull-down assay 31
• 2.8 Deubiquitination assays 31
• 2.9 Cycloheximide chase assay 32
• 2.10 Reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) 32
• 2.11 RNA Sequencing (RNA-seq) and data analysis 33
• 2.12 Cell proliferation, viability, and colony formation 34
• 2.13 Cell migration assay 34
• 2.14 Cell cycle analysis 35
• 2.15 Luciferase reporter assay 35
• 2.16 Immunocytochemistry (ICC) 36
• 2.17 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) 36
• 2.18 Xenograft mouse model 37
• 2.19 Immunohistochemistry (IHC) 37
• 2.20 Public dataset and bioinformatics analyses 38
• 2.21 Statistical analysis 38
• 3. Results
• 3.1 Preliminary observations: PRAME as a melanoma driver
• 3.1.1 Highly expressed PRAME mRNA in melanoma patients 40
• 3.1.2 Reduction of melanoma cell proliferation and survival by PRAME
• depletion 43
• 3.1.3 Transcriptional reprogramming of melanoma by PRAME 46
• 3.2 Part I: PRAME induces p53 inactivation through DBC1 in melanoma
• 3.2.1 Aberrant expression of p53 target genes upon PRAME depletion 49
• 3.2.2 Inverse regulation of p53 target genes by PRAME in melanoma patients · 53
• 3.2.3 Identification of DBC1 as a component of the PRAME complex 57
• 3.2.4 PRAME depletion and SIRT1 inhibition enhance tumor suppression 60
• 3.3 Part II: PRAME cooperates with TFAP2A to repress p21 transcription
• 3.3.1 Delayed p21 induction in PRAME-positive melanoma cell lines 65
• 3.3.2 Co-occupancy of PRAME and TFAP2A at the p21 promoter 68
• 3.3.3 Cooperative repression of p21 by PRAME and TFAP2A 71
• 3.3.4 HDAC1 involvement in PRAME–TFAP2A mediated p21 repression 75
• 3.4 Part III: Epigenetic silencing of primary cilia genes by PRAME and ETS2
• 3.4.1 Inverse association between PRAME and primary cilia formation in
• melanoma 79
• 3.4.2 Regulation of primary cilia formation by PRAME 82
• 3.4.3 Upregulation of cilia-related IFT genes upon PRAME depletion 86
• 3.4.4 Recruitment of PRAME and ETS2 to IFT gene promoters 90
• 3.4.5 Interaction of PRAME with ETS2 and ternary complex formation with
• HDAC1 99
• 3.4.6 Restoration of cilia formation by disruption of the PRAME–ETS2–HDAC1
• complex 105
• 3.5 Part IV: PRAME protein is stabilized by deubiquitinase BAP1
• 3.5.1 Direct interaction between PRAME and BAP1 112
• 3.5.2 Stabilization of PRAME protein by BAP1 117
• 3.5.3 Regulation of PRAME stability by BAP1 deubiquitinase activity 122
• 3.5.4 BAP1-mediated melanoma progression through PRAME stabilization · 126
• 3.5.5 Clinical association of BAP1 and PRAME with poor prognosis in
• melanoma 131
• 4. Discussion 135
• 5. References 144
• 6. Table
• Table 1. Primer list for RT-qPCR assay 160
• Table 2. Primer list for ChIP-qPCR assay 162
• 국문 초록 163
• Acknowledgement (감사의 글) 166