인간 유래 폐암 세포주 A549에 대한 Vorapaxar Sulfate의 항암 활성 = Anticancer Effects of Vorapaxar Sulfate on Human Lung Cancer Cell Line A549

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Cancer cells, characterized by genetic mutations or various other causes, dysregulation of the cell cycle and undergo functional changes, leading to excessive proliferation. Cancer cells metastasize to various parts of the body, including organs, bones, blood, and skin, destroying normal cells and causing them to lose their function, leading to complications and ultimately death. The incidence and mortality rates of cancer are steadily increasing, with lung cancer having the highest mortality rate. Lung cancer can develop for a variety of reasons, and the lungs lack sensory nerves, making early detection challenging. Consequently, lung cancer is often diagnosed at an advanced stage, making resection difficult. Chemotherapy, at this stage, is the only treatment available, not a cure, but rather a life-prolonging treatment. For these reasons, this study aimed to explore lung cancer treatments.
Among 1,700 drugs approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA), we screened for drugs with anticancer activity against the lung cancer cell line A549 and selected active samples, with Vorapaxar Sulfate as the final sample.
Experiments were conducted to determine the antioxidant activity, cytotoxicity, and mechanism of action of Vorapaxar Sulfate. Compared to the positive control group, antioxidant activity was lower. Given the nature of anticancer drugs, high antioxidant activity can impede their effectiveness, so lower antioxidant activity is advantageous for anticancer activity.
To confirm anticancer activity, MTT reduction assay, LDH release assay, colony formation assay, morphological analysis, and Hoechst 33342 staining were performed. As a result, cell viability decreased in a concentration-dependent manner, and cell morphology was observed to include a decrease in volume, nuclear condensation, and increased fluorescence.
Western blot was performed to determine the effect of Vorapaxar Sulfate on the A549 cell cycle. The expression of Rb protein and TopoⅡα protein was confirmed. Rb protein is mainly expressed in the G1 phase and is divided into hypo phosphorylation (p-Rb) and hyper phosphorylation (pp-Rb) forms. The p-Rb form binds to E2F/DP and acts to prevent the transition to S phase, but the binding is broken by the cyclin/CDK complex activated in cancer cells, causing E2F/DP to transition the cell cycle, and p-Rb becomes pp-Rb and loses its tumor suppressor function. Based on this, when Rb expression was confirmed, Rb expression was down regulation at 100 μM, and the expression of pp-Rb was up regulation a concentration of 5-50 μM.
TopoⅡα is a protein expressed throughout the S and G2/M phases and plays a role in DNA replication. TopoⅡα can be expressed as a truncated form smaller than its original size of 170 kDa by proteins expressed in apoptosis. At 100 μM, TopoⅡα expression was down regulation, while the expression of the truncated form up regulation. At concentrations of 5–50 μM, expression of both TopoⅡα and its truncated form was up regulated. At a concentration of 100 μM, protein expression was inhibited due to cell death, while at concentrations of 5–50 μM, protein expression was up regulated. However, given the decreased survival observed in previous experiments, this could be interpreted as an increased expression due to a stress response induced by cell cycle arrest.
Vorapaxar Sulfate exhibits anticancer activity against A549 lung cancer cells, and was confirmed to act across a broad range of cell cycles throughout the G1-M phase, inducing cell cycle arrest, decreased proliferation, and apoptosis. Based on this, this study suggests the potential of Vorapaxar Sulfate as a lung cancer treatment.

국문 초록 (Abstract)

유전적인 돌연변이나 다양한 원인으로 인해 발생되는 암세포는 정상적인 세포주기를 벗어나 기능의 변화를 일으킴으로써 과도한 증식을 유발하게 된다. 암세포는 장기나 뼈, 혈액, 피부조직 등 다양한 신체부위로 전이되어 정상세포를 파괴하며, 그 기능을 상실시키고 합병증으로 인해 사망에 이르게 하는 질병이다. 암의 발병률과 사망률은 꾸준히 증가하고 있으며, 그 중에서도 폐암의 사망률은 가장 높다. 폐암은 다양한 원인으로 인해 발병되게 되며, 폐는 감각신경의 부재로 인해 통증을 느끼기 어려워 조기발견이 어렵다. 그렇기에 폐암의 발견은 이미 병기가 많이 진행된 상태에서 확인되는 경우가 많고 이때는 절제술을 시도하기 어렵기 때문에 항암화학요법으로 완치가 아닌 생명 연장을 위한 치료만이 가능하다. 이러한 이유로 본 연구에서는 폐암 치료제를 탐색하고자 하였다.
미국 연방 식품의약국인 FDA의 승인을 받은 약물 1,700종으로 폐암 세포주인 A549에 항암활성을 띄는 약물을 탐색하여 활성 샘플을 선별하였고, Vorapaxar Sulfate을 최종 샘플로 선정하게 되었다.
Vorapaxar Sulfate의 항산화 활성과, 세포 독성, 작용 기전을 확인하고자 실험을 진행하였다. 항산화 활성은 양성 대조군과 비교하였을 때 낮은 활성을 보였고, 항암제의 특성상 높은 항산화 활성이 항암의 효과를 저해시킬 수 있기 때문에 낮은 것이 항암 작용에는 유리하다.
항암 활성을 확인하기 위해서 MTT reduction assay, LDH release assay, Colony formation assay, Morphological analysis, Hoechst 33342 staining을 실시하였다. 그 결과 세포는 농도 의존적으로 생존율이 감소하였고, 세포의 형태는 부피가 감소하고 핵의 응축이 진행되어 형광의 강도가 증가한 것을 관찰하였다.
Vorapaxar Sulfate가 A549 세포주기에 미치는 영향을 확인하기 위해서 Western blot을 실시하였다. Rb 단백질과 Topo∏α 단백질의 발현을 확인하였다. Rb 단백질은 G1기에 주로 발현이 되며 저인산화(p-Rb)와 과인산화(pp-Rb)의 형태로 나뉘게 된다. 저인산화의 형태는 E2F/DP와 결합되어 S기로의 전환을 막는 역할을 하게 되지만 암세포에서 활성화되는 cyclin/CDK 복합체에 의해서 결합이 끊어지게 되어 E2F/DP는 세포 주기를 전환시키게 되고, p-Rb는 pp-Rb가 되어 종양 억제 기능을 상실하게 된다. 이를 바탕으로 Rb 발현을 확인하였을 때, 100 μM에서는 Rb의 발현이 저하되었으며, 5-50 μM의 농도에서는 pp-Rb의 발현이 증가하였다. Topo∏α는 S, G2/M기 전반에 걸쳐 발현되는 단백질로 DNA의 복제를 돕는 역할을 하게 된다. Topo∏α는 세포 내 사멸이 발생할 때 발현 되는 단백질에 의해 원래 크기의 170 kDa보다 작은 크기의 절단된 형태가 발현될 수 있다. Topo∏α는 100 μM에서는 발현이 저하되었고, 절단된 형태의 발현은 증가하였다. 5-50 μM에서는 Topo∏α와 절단된 형태 모두 발현이 증가하였다. 100 μM에서는 세포의 사멸로 인한 단백질의 저하가 관찰되었고, 5-50 μM에서는 단백질의 발현은 증가하였으나, 앞선 실험을 통해 생존율이 감소되었음으로 이는 세포 내 주기 정지로 인한 스트레스 반응으로 인하여 발현이 증가되었다고 해석할 수 있다.
Vorapaxar Sulfate가 A549 폐암 세포에 대해 항암의 활성을 나타내는 것을 확인하였다. G1-M기 전반에 걸쳐 광범위하게 작용되어 세포 주기의 정지를 유도하여 증식 저하 및 사멸을 유도하였다. 이를 바탕으로 본 연구에서는 Vorapaxar Sulfate의 폐암 치료제 개발 가능성을 제시하는 바이다.

목차 (Table of Contents)

• 국문요약
• 제 1장 서 론 = 1
• 제 2장 폐암 세포주에 항암 활성을 가지는 FDA 승인 약물의 탐색 = 3
• 2.1 서론 = 3
• 2.2 재료 및 방법 = 4
• 2.2.1 세포배양 및 처리 = 4
• 2.3 폐암 세포주에 대한 FDA 승인 의약품 Sample 선별 = 4
• 2.3.1 MTT reduction assay = 4
• 2.4 결과 = 5
• 2.4.1 폐암 세포주에 대한 FDA 승인 의약품 5종의 항암활성 = 5
• 제 3장 Vorapaxar Sulfate의 폐암 세포주 A549에 대한 항암활성 = 7
• 3.1 서론 = 7
• 3.2 재료 및 방법 = 8
• 3.2.1 세포배양 및 처리 = 8
• 3.2.2 Vorapaxar Sulfate 제조 및 보관 = 8
• 3.3 Vorapaxar Sulfate의 항산화 활성 = 8
• 3.3.1 DPPH radical scavenging activity = 8
• 3.3.2 ABTS radical scavenging activity = 9
• 3.4 Vorapaxar Sulfate의 항암 활성 = 10
• 3.4.1 MTT reduction assay = 10
• 3.4.2 LDH release assay = 10
• 3.4.3 Colony formation assay = 11
• 3.4.4 Morphological analysis = 11
• 3.4.5 Hoechst 33342 staining = 12
• 3.5 Vorapaxar Sulfate의 항암 기전 = 12
• 3.5.1 단백질 추출 = 12
• 3.5.2 Western blot analysis = 13
• 3.6 결과 = 14
• 3.6.1 Vorapaxar Sulfate의 항산화 활성 평가 = 14
• 3.6.2 Vorapaxar Sulfate의 A549 세포주에 대한 항암 활성 평가 = 15
• 3.6.3 Vorapaxar Sulfate의 A549 세포주에 대한 항암 활성 기전 = 16
• 제 4장 결론 = 28
• 참고문헌 = 30
• ABSTRACT = 33