농산 부산물로부터 간세포를 보호하는 생리활성물질의 탐색 = Screening for Hepatoprotective Bioactive Compounds from Agricultural By-products

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Global population growth has significantly increased the demand for food resources, leading to a corresponding surge in the discharge of agricultural by-products. While these by-products cause environmental pollution and economic loss when discarded, they have recently gained attention as high-value resources rich in bioactive compounds. In this study, eco-friendly subcritical water extraction (SWE) was applied to agricultural by-products to identify substances capable of protecting the liver, a central metabolic organ highly susceptible to oxidative stress, and to validate their efficacy.
Initially, subcritical water extracts were prepared from six types of agricultural by-products (lemon peel, orange peel, banana peel, walnut shell, peanut shell, and roasted peanut skin) to evaluate their antioxidant activities. All extracts exhibited over 60% DPPH radical scavenging activity, with roasted peanut skin (RPS) showing the highest total phenolic content (2,427.8 μg GAE/mL). Subsequent screening on HepG2 cells induced with tert-butyl hydroperoxide (t-BHP) revealed that the RPS subcritical water extract (RPS-SWE) yielded the highest cell viability (67.5%) and was thus selected as the final sample.
To verify the hepatoprotective activity of RPS-SWE, MTT reduction, LDH release, and Colony formation assays, as well as Morphological analysis, were performed. The MTT assay results showed that cell viability, which had decreased to 32.6% due to t-BHP treatment, dose-dependently increased to 75.8% at a 2% concentration of RPS-SWE. Conversely, LDH release, an indicator of cell membrane damage, significantly decreased, confirming effective inhibition of membrane destruction. Furthermore, the analysis of cell proliferation and colony formation ability revealed that the viability rate, which was only 8.8% in the t-BHP-only group, increased more than four-fold to 37.5% in the 2% RPS-SWE group. These findings were consistent with the Morphological analysis, which showed alleviated cell shrinkage and maintenance of normal cell density, thereby proving the superior hepatoprotective activity of RPS-SWE.
To identify the chemical structure of the active substance within RPS-SWE, isolation and purification were conducted using ethyl acetate fractionation, Silica gel column chromatography, and HPLC. LC-QTOF MS analysis identified the compound as Urolithin C (molecular weight: 244.03). Urolithin C, a compound with a lactone ring structure, was confirmed as a key indicator component responsible for suppressing oxidative liver cell damage.
In conclusion, this study demonstrates that roasted peanut skin(Arachis hypogaea L.), a commonly discarded agricultural by-product, can be successfully upcycled into high-value resources through subcritical water processing. Furthermore, the identified Urolithin C presents significant potential as a natural functional material and a lead compound for the development of novel hepatoprotective agents.

국문 초록 (Abstract)

전 세계적인 인구 증가는 식량 자원의 수요를 높였으며, 그 과정에서 발생하는 농산 부산물(Agricultural by-products)의 배출량 또한 함께 급증하였다. 농산 부산물은 단순 폐기 시 환경오염과 경제적 손실을 초래하지만, 최근 풍부한 생리활성물질을 함유한 고부가가치 자원으로서 주목받고 있다. 본 연구에서는 인체 대사의 중심이자 산화 스트레스에 취약한 ‘침묵의 장기’인 간을 보호하는 물질을 탐색하기 위해 농산 부산물을 대상으로 친환경 아임계수 추출법(Subcritical water extraction)을 적용하여 유효 성분을 추출하고 그 효능을 검증하고자 하였다.
먼저 6종의 농산 부산물(레몬껍질, 오렌지껍질, 바나나껍질, 호두껍질, 땅콩껍질, 볶음땅콩껍질) 아임계수 추출물을 제조하여 항산화 활성을 평가하였다. 실험 결과, 모든 추출물에서 60% 이상의 DPPH 라디칼 소거능이 확인되었으며, 볶음땅콩껍질 추출물에서 2,427.8 μg GAE/mL의 가장 높은 총 폴리페놀 함량을 확인하였다. 이어 tert-butyl hydroperoxide(t-BHP)로 산화 스트레스를 유도한 HepG2 세포주에 대한 스크리닝 결과, 볶음땅콩껍질 아임계수 추출물(RPS-SWE)이 67.5%의 가장 우수한 세포생존율을 나타내어 최종 시료로 선정되었다.
RPS-SWE의 간세포 보호 활성을 검증하기 위해 MTT reduction assay, LDH release assay, Colony formation assay 및 Morphological analysis를 실시하였다. MTT assay 결과, t-BHP 처리로 32.6%까지 감소했던 세포생존율은 RPS-SWE의 처리 시 농도의존적으로 증가하여 2% 농도에서 75.8%의 우수한 보호 효과를 나타냈으며, 세포막 손상의 지표인 LDH 방출량은 반대로 유의미하게 감소하여 산화 스트레스에 의한 세포막 파괴를 효과적으로 억제함을 확인하였다. 또한 세포의 증식 및 군집 형성 능력을 분석한 결과, t-BHP의 단독 처리 시 8.8%에 불과했던 생존율이 2% RPS-SWE 처리군에서는 37.5%로 약 4배 이상 증가하였다. 이는 형태학적 관찰에서 나타난 세포 응축 완화 및 정상 밀도 유지 결과와 일치함으로써 RPS-SWE의 우수한 간세포 보호 활성을 입증하였다.
RPS-SWE 내 활성물질의 화학구조를 규명하고자 Ethyl acetate 분획, Silica-gel column chromatography 및 HPLC를 통한 분리·정제를 진행하였으며, LC-QTOF MS 분석 결과, 해당 화합물은 분자량 244.03의 Urolithin C로 동정되었다. Urolithin C는 lactone 구조를 가진 화합물로, 본 연구를 통해 산화 스트레스에 의한 간세포 손상을 억제하는 핵심 지표 성분임이 확인되었다.
결론적으로 본 연구에서는 폐기되는 농산 부산물인 볶음땅콩껍질이 아임계수 공정을 통해 고부가가치 자원으로 전환될 수 있음을 입증하였으며, 최종 규명된 Urolithin C는 향후 천연물 유래 기능성 소재 및 간 질환 예방을 위한 간 보호제로서의 활용 가능성을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• 국문요약
• 제 1장 서론 = 1
• 제 2장 농산 부산물 아임계수 추출물의 항산화 활성 및 간세포 보호 효과 = 3
• 2.1 서론 = 3
• 2.2 재료 및 방법 = 4
• 2.2.1 실험재료 및 시약 = 4
• 2.2.2 추출물 제조 = 5
• 2.2.3 DPPH radical scavenging assay = 5
• 2.2.4 Total Phenolic Content = 6
• 2.2.5 세포주 배양 및 처리 = 6
• 2.2.6 MTT reduction assay = 7
• 2.2.7 Morphological analysis = 7
• 2.2.8 MTT reduction assay = 8
• 2.3 결과 = 8
• 2.3.1 농산 부산물 아임계수 추출물의 항산화 활성 = 8
• 2.3.2 t-BHP를 처리한 HepG2 세포주의 세포생존율 및 형태학적 변화 9
• 2.3.3 손상된 HepG2 세포주에 대한 농산 부산물 아임계수 추출물의 간세포 보호 효과 비교 = 10
• 제 3장 볶음땅콩껍질 아임계수 추출물의 간세포 보호 활성 = 16
• 3.1 서론 = 16
• 3.2 재료 및 방법 = 17
• 3.2.1 실험재료 및 시약 = 17
• 3.2.2 추출물 제조 = 17
• 3.2.3 세포주 배양 및 처리 = 18
• 3.2.4 MTT reduction assay = 18
• 3.2.5 LDH release assay = 18
• 3.2.6 Colony formation assay = 19
• 3.2.7 Morphological analysis = 19
• 3.3 결과 = 20
• 3.3.1 HepG2 세포주의 산화적 손상에 대한 RPS-SWE의 보호 활성 = 20
• 제 4장 RPS-SWE로부터 간세포 보호 물질의 분리·정제 및 구조결정 = 26
• 4.1 서론 = 26
• 4.2 방법 및 결과 = 26
• 4.2.1 RPS-SWE로부터 생리활성물질의 분리 및 정제 26
• 4.2.2 RPS-25-34의 구조결정 = 27
• 4.2.3 Urolithin C의 물리·화학적 특성 및 생물학적 활성 = 28
• 제 5장 결론 = 35
• 참고문헌 = 37
• ABSTRACT = 41