Streptomyces cattleya NRRL 8057의 S-Adenosyl-L-methionine(SAM) synthetase를 encoding하는 metK 유전자의 클로닝과 기능분석 = Cloning and functional analysis of a metK gene encoding S-Adenosyl-L-methionine(SAM) synthetase of Streptomyces cattleya NRRL 8057

국문 초록 (Abstract)

방선균(Actinomycetes)은 토양을 비롯한 다양한 자연환경에 서식하며 항생제를 포함한 다양한 이차대사산물을 생산하는 대표적인 미생물군으로 알려져 있다. 특히, 방선균이 생산하는 이차대사산물은 의약, 농업, 생명공학 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 활용되고 있으며, 방선균의 이차대사산물 생합성 및 조절 메커니즘에 대한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.
Streptomyces cattleya는 현재까지 보고된 방선균 중 유일하게 carbapenem 계열 항생제인 thienamycin을 생산하는 종으로 주목받고 있다. Thienamycin은 β-lactamase 내성을 지닌 세균을 포함한 다양한 병원균에 대해 강력한 항균 활성을 나타낸다. 따라서 임상에서는 구조적으로 안정화된 유도체인 imipenem이 cilastatin과 병용되어 폐렴, 요로감염, 복강 내 감염 등 다양한 세균 감염 질환 치료에 활용되고 있다. 그러나 thienamycin은 이러한 의약학적 가치를 지닌 항생물질임에도 불구하고 thienamycin 생합성 조절 메커니즘에 대한 연구는 매우 제한적이기 때문에 생합성 조절 기작에 대한 연구가 시급한 상황이다.
방선균의 이차대사산물 생합성 조절은 global regulator system(GRS)과 specific regulator system이 관여하며, 본 논문에서는 GRS의 대표적인 조절 기작 중 SAM regulation에 대한 연구를 진행하게 되었다. S-adenosylmethionine(SAM)은 metK 유전자가 encoding하는 SAM synthetase에 의해 합성되는 물질로, 다양한 메틸화 반응에서 메틸기 공여체로 작용한다. 또한, SAM은 이차대사산물 생합성에 관여하는 pathway-specific regulator의 발현을 유도함으로써 이차대사산물 생합성 조절에 직접적인 영향을 주는 연구결과들이 제시되어 왔다.
따라서 본 연구에서는 S. cattleya의 orf5(metK) 유전자가 thienamycin 생산 및 형태분화에 미치는 영향을 분석하기 위해, SAM synthetase를 암호화하는 orf5(metK) 유전자를 S. cattleya NRRL 8057로부터 cloning하고 해당 유전자의 고발현 및 파괴 균주를 제작하였다. 제작된 각 균주는 wild-type 균주와 비교하여 균체량, thienamycin 생산량, 형태학적 분화 및 포자량 변화를 분석하였다. 그 결과, orf5(metK) 고발현 균주는 wild-type에 비해 균체량과 포자 형성이 억제되었으나 thienamycin 생산량은 약 2.7배 증가하였다. 반면, orf5(metK) 유전자 파괴 균주는 wild-type 균주에 비해 배양 120시간 이후부터 균체 성장이 억제되었고, thienamycin 생산량 또한 약 3.8배 감소하였으며, 모든 배지에서 균체 성장과 포자량이 억제되었다. 이러한 결과는 orf5(metK) 유전자의 발현 변화에 따른 세포내 SAM level 변화가 1차 대사 및 항생제 생합성 조절에 영향을 미치게 되어, 결국 thienamycin 생합성 및 포자 생산이 억제된 것으로 판단된다.
따라서 본 연구를 통해 S. cattleya NRRL 8057의 orf5 유전자가 thienamycin 생합성을 촉진하는 positive regulator로 작용함과 동시에 균체 성장 및 포자 형성을 조절하는 metK 유전자라는 것으로 확인하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Actinomycetes are a representative group of microorganisms widely distributed in diverse natural environments, including soil. They are known to produce a wide range of secondary metabolites, including antibiotics, which are extensively utilized in the pharmaceutical, agricultural and biotechnology industries.
Streptomyces cattleya has attracted attention as the only actinomycete known to produce the carbapenem antibiotic thienamycin, which exhibits potent antimicrobial activity against a broad spectrum of pathogens, including β-lactamase-producing bacteria. However, despite its significant pharmaceutical value, the regulatory mechanisms underlying thienamycin biosynthesis remain poorly understood, highlighting the need for further investigation into its biosynthetic regulation.
The biosynthesis of secondary metabolites in actinomycetes is regulated by global regulator systems(GRS) and pathway-specific regulatory systems. Among these, S-adenosylmethionine(SAM) regulation represents a major global regulatory mechanism. SAM is synthesized by SAM synthetase encoded by the metK gene and functions as a methyl group donor in various methylation reactions. Previous studies have shown that SAM affects secondary metabolite biosynthesis by inducing the expression of pathway-specific regulators.
In this study, the effects of the orf5(metK) gene on thienamycin production and morphological differentiation in S. cattleya NRRL 8057 were investigated. The orf5(metK) gene was cloned, and both overexpression and gene-disruption mutants were constructed. Compared with the wild-type strain, the orf5(metK)-overexpressing strain exhibited a 2.7-fold increase in thienamycin production, while biomass accumulation and spore formation were reduced. In contrast, the orf5(metK)-disruption mutant showed reduced biomass growth after 120 h of cultivation, accompanied by an approximately 3.8-fold decrease in thienamycin production, as well as reduced biomass accumulation and spore formation across all media tested. These results suggest that changes in the expression of the orf5(metK) gene lead to alterations in intracellular SAM levels, which in turn affect the regulation of primary metabolism and antibiotic biosynthesis, ultimately resulting in the suppression of thienamycin production and spore formation.
In conclusion, this study confirmed that the orf5 gene in S. cattleya NRRL 8057 acts as a positive regulator of thienamycin biosynthesis, while also regulating biomass growth and spore formation as the metK gene.

목차 (Table of Contents)

• 국문요약 = ⅶ
• Ⅰ. 서론 = 1
• 1. Characteristic of actinomycetes = 1
• 2. Global regulatory system in Streptomyces = 3
• 3. Biosynthesis and functions of SAM in Streptomyces = 6
• 3.1. S-adenosylmethionine(SAM) = 6
• 3.2. S-adenosylmethionine synthetase(SAM-s) = 7
• 3.3. Impact of SAM on secondary metabolism in Streptomyces = 9
• 4. Streptomyces cattleya that produces thienamycin = 10
• Ⅱ. 재료 및 방법 = 14
• 1. Bacterial strain and plasmid = 14
• 2. Media and culture condition = 17
• 3. Gene cloning and PCR = 19
• 3.1. Extraction of chromosomal DNA from S. cattleya = 19
• 3.2. Design of PCR primer for search of orf5(metK) = 20
• 3.3. Transformation and plasmid isolation = 26
• 3.4. Agarose gel electrophoresis and DNA elution = 27
• 3.5. DNA sequencing and homology analysis = 28
• 3.6. Construction of orf5(metK) gene over-expression vector = 29
• 3.7. Construction of orf5(metK) gene-disruption vector = 30
• 4. Conjugation = 31
• 5. Morphological analysis in solid medium = 32
• 6. Liquid culture for thienamycin production = 33
• 7. Bioassay analysis of thienamycin = 34
• Ⅲ. 결과 및 고찰 = 35
• 1. Cloning of orf5(metK) gene from S. cattleya = 35
• 1.1. Identification of orf5(metK) gene in S. cattleya = 35
• 1.2. Sequencing and ORF analysis of 10 kb fragment = 40
• 2. Construction of orf5(metK) gene over-expression strain = 42
• 3. Construction of orf5(metK) gene disrupted strain through homologous recombination = 45
• 4. Effect of orf5(metK) gene over-expression on thienamycin production of S. cattelya = 48
• 5. Effect of orf5(metK) gene over-expression on morphological differentiation of S. cattleya = 51
• 6. Effect of orf5(metK) gene-disruption on thienamycin production of S. cattelya = 57
• 7. Effect of orf5(metK) gene-disruption on morphological differentiation of S. cattleya = 60
• Ⅳ. 결론 = 66
• REFERENCES = 69
• ABSTRACT = 77