Anti-obesity Effect of Mango (Mangifera indica L. Irwin) Leaf Extracts through Regulation of Adipogenesis = 망고 (Mangifera indica L. Irwin) 잎 추출물의 지방세포 분화 조절을 통한 항비만 효과

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Obesity is a major global public health problem closely associated with oxidative stress and excessive adipogenesis. Mango (Mangifera indica L. Irwin) leaves are known to contain various phytochemicals, such as mangiferin and gallic acid. However, mango leaves generated during pruning are discarded as agricultural by-products. In this study, the anti-oxidant and anti-obesity effects of Mangifera indica L. Irwin leaf water extract (MLW) and Mangifera indica L. Irwin leaf 70% (v/v) ethanol extract (MLE) were evaluated, and their potential as functional food ingredients was investigated. The anti-oxidant activities of MLW and MLE were evaluated by measuring the total phenolic contents, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical scavenging activity and copper reduction power. Both MLW and MLE demonstrated anti-oxidant activity, with MLE showing higher total phenolic content and radical scavenging activity compared with that in MLW. Oil Red O staining to evaluate the effects of mango leaf extracts on lipid accumulation revealed that treatment with MLW and MLE significantly inhibited lipid accumulation in differentiated adipocytes compared with that in the adipocyte control group. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis revealed that MLW and MLE downregulated the expression of adipogenesis-related genes, and this effect was more pronounced in the MLE-treated group. To determine the adipogenesis stage at which MLW and MLE most effectively exert their inhibitory effects, 3T3-L1 cells were treated with the extracts at various differentiation stages and subjected to Oil Red O staining. The results revealed that treatment during the early stage of differentiation was most effective at decreasing lipid accumulation. Further, RT-PCR analysis revealed that treatment during the early stage of differentiation decreased the mRNA expression of CCAAT/enhancer-binding protein beta (C/EBPβ), peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ), and CCAAT/enhancer-binding protein alpha (C/EBPα), and that this inhibitory effect on gene expression was more pronounced in the MLE-treated group compared with that in the MLW-treated group. Western blot analysis to identify the signaling pathways through which MLW and MLE regulate adipogenesis revealed that MLW increased the expression of phosphorylated protein kinase B (p-Akt) in the insulin signaling pathway and decreased p-β-catenin in the Wnt/β-catenin pathway, whereas MLE decreased phosphorylated protein kinase A (p-PKA) in the cyclic adenosine monophosphate (cAMP) signaling pathway and increased p-Akt in the insulin pathway. Together, these findings indicate that mango leaf extracts exert anti-oxidant and anti-adipogenic activities and may serve as promising natural ingredients for functional food applications.

국문 초록 (Abstract)

비만은 21세기 가장 심각한 공중보건 문제 중 하나로, 개인의 문제를 넘어 사회, 경제적으로 큰 부담을 주고 있다. 비만은 음식물의 과잉 섭취뿐만 아니라 운동 부족, 내분비 이상, 유전적 요인 등에 의해 발생하며 지방세포의 수와 크기 증가가 주요 원인으로 작용하고 있다. 특히 산화 스트레스가 비만과의 핵심 연결고리로 작용하며, 산화 스트레스의 과잉은 비만의 진행을 촉진한다. 최근 산화 스트레스가 비만의 발병 그리고 진행에 핵심적인 역할을 한다는 연구 결과들이 보고되면서, 활성산소 (reactive oxygen species, ROS)를 억제하는 전략이 비만의 예방 그리고 치료를 위한 접근법으로 주목받고 있으며, 식품 부산물과 천연자원을 활용한 항산화제 개발은 기능성 식품 및 자연 유래 질병 예방 소재로서의 활용 가치를 높이고 있다. 본 연구에서는 재배 과정에서 버려지는 망고 (Mangifera indica L. Irwin) 잎을 활용하여 항비만 효과 및 작용기전을 규명하고자 하였다. 망고 잎 추출물의 항산화 및 항비만 효과를 평가하기 위해 열수 추출물 (Mangifera indica L. Irwin leaf water extract, MLW)과 70% 에탄올 추출물 (Mangifera indica L. Irwin leaf 70% (v/v) ethanol extract, MLE)로 제조하여 실험에 사용하였다. 총 폴리페놀 함량, DPPH radical 소거 활성 그리고 환원력을 평가하여 MLW와 MLE의 항산화 활성을 평가하였으며 Oil Red O 염색을 통해 항비만 효과를 확인하였다. 또한, RT-PCR과 western blot을 통해 adipogenesis 관련 유전자와 단백질 발현 수준을 분석하였다. 항산화 효과를 평가하기 위해 MLW와 MLE를 DMSO로 10, 25, 50 그리고 100 μg/mL의 농도로 희석하여 사용하였다. 총 폴리페놀 함량과 DPPH radical 소거 활성 능력은 MLE가 MLW 보다 뛰어난 활성을 나타내었으며, 두 추출물 모두 radical 소거 활성 능력이 농도 의존적으로 증가하였다. 환원력 평가에서는 MLW가 100 μg/mL의 농도에서 양성 대조군으로 사용한 ascorbic acid보다 높은 활성을 보였으며 농도 의존적으로 환원력이 증가하였다. MLW와 MLE가 3T3-L1 세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 평가하기 위해 MTT assay를 통해 확인하였으며, MLW는 세포 생존율에 영향을 미치지 않은 반면, MLE는 200 μg/mL의 농도에서부터 세포 생존율이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 이후 실험에서는 MLW와 MLE를 100 μg/mL 이하의 농도를 이용하여 실험을 진행하였다. 3T3-L1 전지방세포에 분화 유도물질을 처리하고, 분화된 지방세포를 이용하여 MLW와 MLE의 지질 축적 억제 효과를 평가하였다. Oil Red O 염색을 통한 정성, 정량 분석 결과, 두 추출물은 분화를 유도한 adipocytes 군에 비하여 유의하게 지질 축적을 억제하였으며, MLE가 MLW보다 더 효과적으로 지질 축적을 억제하였다. MLW와 MLE의 처리가 adipogenesis 관련 유전자에 미치는 영향을 확인하기 위하여 RT-PCR 분석을 진행하였다. MLW와 MLE의 처리는 C/EBPβ, PPARγ 그리고 C/EBPα 등의 adipogenesis 관련 유전자의 발현을 유의적으로 감소시켰으며, 두 추출물이 지방세포의 초기 분화 단계부터 후기 단계까지 전반적으로 영향을 미치는 것을 확인하였다. 망고 잎 추출물이 adipogenesis의 초기, 중기 그리고 후기 단계 중 어느 시점에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 MLW와 MLE를 100 μg/mL의 농도로 기간별로 처리한 후 Oil Red O 염색을 진행하였다. 두 추출물은 분화 유도 초기와 중기 단계에 지질 축적을 유의하게 억제하였다. 초기 단계에 MLW와 MLE를 처리한 후 RT-PCR 분석을 통해 유전자 발현 수준을 확인한 결과, 초기 분화를 유도하는 전사인자 C/EBPβ와 중기와 후기 단계의 전사인자인 PPARγ, C/EBPα 그리고 adiponectin의 발현 수준까지 유의하게 감소한 것을 확인하였다. 망고 잎 추출물이 adipogenesis 조절에 관여하는 기전을 규명하고자, cAMP, insulin 그리고 Wnt/β-catenin 신호전달 경로의 주요 단백질인 p-PKA, p-Akt 그리고 p-β-catenin의 단백질 발현 수준을 western blot으로 분석하였다. Western blot 결과, MLW는 p-Akt의 발현을 증가시키고 p-β-catenin의 발현을 감소시켰으며, MLE는 p-PKA의 발현을 감소시키고 p-Akt의 발현을 증가시켰다. 이러한 결과는 MLW가 insulin과 Wnt/β-catenin 신호전달 경로를 통해 adipogenesis를 억제하고, MLE는 cAMP와 insulin 신호전달 경로를 통해 adipogenesis를 억제할 가능성을 시사하였다. 본 연구의 결론은 망고 잎 추출물이 항산화 효과를 나타내고, cAMP, insulin 그리고 Wnt/β-catenin 신호전달 경로를 통해 adipogenesis 핵심 전사인자들의 발현을 억제하여 항비만 효과를 나타내었다. 이러한 망고 잎의 활용은 효과적으로 비만을 예방하고 치료할 수 있다는 증거를 제시하며 기능성 식품의 원료로서의 활용 가능성을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT = ⅶ
• Ⅰ. INTRODUCTION = 1
• 1. Obesity = 1
• 2. Anti-oxidants = 3
• 3. Adipogenesis = 5
• 4. Mango (Mangifera indica L. Irwin) leaves = 8
• 5. Objectives of this study = 10
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS = 11
• 1. Chemicals and materials = 11
• 2. Preparation of mango (Mangifera indica L. Irwin) leaf extracts = 13
• 3. Anti-oxidant activities of MLW and MLE = 14
• 3.1. Total phenolic contents = 14
• 3.2. DPPH radical scavenging activity = 14
• 3.3. Copper reduction potential = 15
• 4. Anti-adipogenic effects of MLW and MLE treatment in 3T3-L1 cells = 16
• 4.1. 3T3-L1 cell culture = 16
• 4.2. Cell viability assay = 16
• 4.3. Differentiation of 3T3-L1 cells = 17
• 4.4. Oil Red O staining = 20
• 5. Isolation of total RNA and RT-PCR analysis = 21
• 6. Western blot analysis of protein expression in 3T3-L1 = 23
• 7. Statistical analysis = 24
• Ⅲ. RESULTS AND DISCUSSION = 25
• 1. Extraction yield of MLW and MLE = 25
• 2. Effects of MLW and MLE on anti-oxidant activities = 27
• 2.1. Total phenolic contents of MLW and MLE = 27
• 2.2. DPPH radical scavenging activities of MLW and MLE = 30
• 2.3. Copper reduction potential of MLW and MLE = 33
• 3. Effects of MLW and MLE treatment on the viability of 3T3-L1 preadipocytes = 36
• 4. Effects of MLW and MLE treatment on the adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes = 38
• 4.1. Inhibitory effects of MLW and MLE treatment on adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes = 38
• 4.2. Regulation of adipogenesis-related mRNA expression levels with MLW and MLE in 3T3-L1 adipocytes = 42
• 4.3. Inhibitory effects of MLW and MLE treatment on adipogenesis at different stages of 3T3-L1 adipocyte differentiation = 51
• 4.4. Regulation of adipogenesis-related mRNA expression levels by MLW and MLE treatment at different stages of 3T3-L1 adipocyte differentiation = 55
• 4.5. Regulation of protein expression levels in adipogenesis-related signaling pathways by MLW and MLE treatment in 3T3-L1 adipocytes = 60
• Ⅳ. CONCLUSION = 65
• REFERENCES = 68
• LIST OF ABBREVIATIONS = 86
• 국문요약 = 90