Understanding the molecular pathogenesis of the diabetes-related genes UCHL1, WFS1, and CISD2 = 당뇨병 관련 유전자 UCHL1, WFS1, CISD2의 분자병리기전 이해

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Diabetes mellitus is a metabolic disorder characterized by sustained hyperglycemia, which can lead to serious complications such as neuropathy, retinopathy, renal failure, stroke, and cardiovascular disease. It is broadly classified into type 1 diabetes, caused by insulin deficiency, and type 2 diabetes, primarily driven by insulin resistance. In this study, I propose ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 (UCHL1), Wolfram syndrome 1 (WFS1), and CDGSH iron sulfur domain 2 (CISD2) as diabetes-related genes, and elucidate their underlying molecular mechanisms. Insulin resistance, a hallmark of type 2 diabetes, results from disrupted insulin signaling. I demonstrate that UCHL1, a deubiquitinating enzyme, regulates insulin signaling by deubiquitinating and stabilizing insulin receptor substrate 1 (IRS1). UCHL1 exhibits substrate specificity for IRS1 over its paralog UCHL3, conferred by its substrate recognition loop. Additionally, Cullin 1 (CUL1) plays an antagonistic role by ubiquitinating IRS1 at lysine residues K523, K538, K759, K867, and K943, which overlap with UCHL1’s targets. Pharmacological inhibition of CUL1 using a neddylation inhibitor restores impaired insulin signaling in UCHL1-deficient cells. Wolfram syndrome is a rare genetic disorder primarily associated with juvenile-onset diabetes mellitus, optic atrophy, diabetes insipidus, and sensorineural hearing loss. WFS1 and CISD2 are causative genes of Wolfram syndrome types 1 and 2, respectively. I establish cellular and Drosophila models of Wolfram syndrome and find that deficiency of WFS1 or CISD2 disrupts ER calcium homeostasis, leading to type 1 diabetes–like phenotypes. Notably, WFS1 and CISD2 mutually compensate for each other’s loss in vivo. Mechanistically, both proteins physically interact with and regulate inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (IP3R) activity. A synthetic CISD2-derived peptide containing its CDGSH domain restores calcium homeostasis in WFS1- and CISD2-deficient cells and ameliorates diabetes-like phenotypes in mutant flies. Moreover, a cell-penetrating peptide (CPP)-conjugated form of the CISD2 peptide effectively rescues calcium dysregulation, highlighting its potential as a therapeutic candidate for Wolfram syndrome and type 1 diabetes. Collectively, these findings identify UCHL1, WFS1, and CISD2 as critical genetic factors in the pathogenesis of diabetes mellitus, acting through insulin signaling and calcium homeostasis. This study deepens the molecular understanding of diabetes and provides a conceptual basis for the development of targeted therapeutic strategies.

국문 초록 (Abstract)

당뇨병은 만성 고혈당을 특징으로 하는 대사 질환으로, 신경병증, 망막병증, 신부전, 뇌졸중, 심혈관 질환 등 다양한 합병증을 유발할 수 있다. 당뇨병은 크게 인슐린 결핍에 의해 발생하는 제1형 당뇨병과 인슐린 저항성에 의해 유발되는 제2형 당뇨병으로 구분된다. 본 연구에서는 ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 (UCHL1), Wolfram syndrome-1 (WFS1), CDGSH iron sulfur domain 2 (CISD2)를 당뇨병 연관 유전자로 제안하고, 이들의 분자적 병리기전을 규명하였다. 제2형 당뇨병의 주요 병리적 특징인 인슐린 저항성은 인슐린 신호 전달의 손상으로부터 비롯된다. 본 연구에서는 탈유비퀴틴화 효소인 UCHL1이 insulin receptor substrate 1 (IRS1)을 탈유비퀴틴화하고 안정화시켜 인슐린 신호를 조절함을 밝혔다. UCHL1은 substrate recognition loop를 통해 paralog인 UCHL3 보다 IRS1에 대해 높은 기질 특이성을 보였다. 반면, Cullin 1 (CUL1)은 IRS1의 유비퀴틴화를 통해 UCHL1과 길항적 기능을 수행하였으며, 이 과정에서 K523, K538, K759, K867, K943 잔기를 공유 표적으로 삼았다. Neddylation 억제제를 통해 CUL1의 활성을 저해하여 UCHL1 결핍에 의해 손상된 인슐린 신호를 회복시켰다. 볼프람중후군은 희귀 유전질환으로, 주로 소아기 발병 당뇨병, 시신경 위축, 요붕증, 감각신경성 난청 등을 동반한다. WFS1과 CISD2는 각각 볼프람증후군 1형과 2형의 원인 유전자로 알려져 있다. 본 연구에서는 볼프람증후군의 모델 세포주와 모델 초파리를 구축하였으며, WFS1 또는 CISD2의 결손이 소포체 칼슘 항상성을 무너뜨리고, 제1형 당뇨병 유사 표현형을 유도함을 확인하였다. 특히, WFS1과 CISD2는 생체 내에서 상호 결손을 보완하는 기능적 관계를 가짐을 관찰하였다. 기전적으로는, 두 단백질이 모두 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (IP3R)와 물리적으로 결합하고, 그 활성을 조절하는 것으로 나타났다. CISD2 단백질의 CDGSH 도메인 서열을 포함한 펩타이드를 제작하여 WFS1 및 CISD2 결손 세포에서의 칼슘 항상성을 회복시키는 것을 확인하였고, 해당 CISD2 펩타이드로 돌연변이 초파리에서도 당뇨병 유사 표현형을 완화하였다. 더 나아가, 세포 투과성 펩타이드 (cell-penetrating peptide, CPP)가 결합된 CISD2 펩타이드는 WFS1 또는 CISD2 결손 세포의 칼슘 불균형을 효과적으로 교정하였으며, 이는 해당 펩타이드가 볼프람증후군 및 제1형 당뇨병의 치료 후보 물질로서의 가능성을 지님을 시사한다. 이와 같은 결과들을 종합하면, UCHL1, WFS1, CISD2는 당뇨병 병태생리에 관여하는 핵심 유전자로, 각각 인슐린 신호와 칼슘 항상성 경로를 통해 기능함을 보여준다. 본 연구는 당뇨병에 대한 분자적 이해를 심화하였으며, 표적 치료 전략 개발을 위한 개념적 기반을 제안한다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• Table of Contents iv
• List of Figures vi
• Introduction 1
• Materials and Methods 21
• Results and Discussion 34
• PART 1. UCHL1 regulates insulin signaling via stabilizing IRS1 35
• Loss of UCHL1 reduces insulin signaling in cells 36
• UCHL1 regulates insulin signaling by deubiquitinating IRS1, thereby stabilizing it 40
• IRS1 is a specific substrate of UCHL1, but not of UCHL3 48
• E3 ligase CUL1 antagonizes the role of UCHL1 56
• TAS4464, a Cullin1 neddylation inhibitor, rescues decreased insulin signaling in UCHL1 knockout cells 66
• Discussion 69
• PART 2. Reciprocal rescue of Wolfram syndrome by WFS1 and CISD2 72
• Loss of WFS1 or CISD2 leads to abnormal IP3R activity 73
• Loss of WFS1 or CISD2 leads to Wolfram syndrome-related diabetes-like phenotypes in Drosophila 83
• WFS1 and CISD2 interact with IP3R via distinct regions 89
• WFS1 and CISD2 independently interact with IP3R and reciprocally rescue diabetes-like phenotypes in dWFS1 or dCISD mutant flies 98
• Overexpression of CISD2 peptide increases IP3R activity and ameliorates diabetes-like phenotypes in dWFS1 or dCISD mutant flies 105
• Treatment of CISD2 cell-penetrating peptide rescues altered calcium modulation in WFS1 or CISD2 knockout cells 117
• Discussion 123
• Limitations of the Study 132
• Conclusion 134
• References 138
• Abstract in Korean 150