Studies on the Regulatory Mechanism of CHFR Ub-ligase Activity upon Cellular Damage = 세포 손상에 따른 CHFR Ub-ligase의 활성 조절 기전에 관한 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

CHFR (Checkpoint with FHA and RING domains) is a checkpoint protein and tumor suppressor whose reduced expression or loss-of-function mutations are directly implicated in tumorigenesis. Through its E3 ubiquitin ligase activity, CHFR suppresses cancer development by regulating key oncogenes including PLK1 and HDAC1. However, CHFR’s regulatory network extends far beyond tumor suppression, encompassing diverse cellular processes such as cell cycle progression and apoptosis (CyclinB1, PLK1, Aurora A), inflammatory responses (NF-κB), oxidative stress responses (SIRT1), and adherens junction maintenance (VE-cadherin). Despite this broad functional scope, the mechanisms underlying CHFR’s multiplexed regulatory capacity remain poorly understood. To address this gap, I investigated the upstream regulatory networks that channel cellular damage signals to CHFR and defined its position within cellular damage response pathways. This study reveal that CHFR responds to cellular damage through regulation by two distinct upstream kinases: ATR and JNK. Phosphorylation by ATR integrates CHFR into DNA damage response pathways, while JNK-mediated phosphorylation incorporates CHFR into oxidative stress response networks. Remarkably, despite sharing the same regulatory mechanism of phosphorylation, CHFR exhibits opposing functional outcomes depending on the upstream kinase involved.
Following DNA damage, CHFR undergoes ATR-mediated phosphorylation and subsequent post-translational modifications. In contrast to JNK-mediated regulation, ATR phosphorylation stabilizes CHFR protein levels rather than promoting degradation. This stabilization coincides with decreased CHFR autoubiquitination activity and enhanced binding affinity for PLK1, a critical mitotic regulator, resulting in increased ubiquitin chain formation on PLK1. When we abolished CHFR’s phosphorylation capacity through site-directed mutagenesis of identified phosphorylation sites, CHFR lost its ability to induce apoptosis in damaged cells and subsequently failed to inhibit cell proliferation. Given that CHFR’s regulatory control over PLK1 plays a crucial role in pancreatic cancer progression, phosphorylation-dependent CHFR regulation represents an essential mechanism for its tumor suppressor function.
Under oxidative stress conditions, CHFR exhibits markedly different behavior, showing increased autoubiquitination activity that leads to substantial protein destabilization through proteasome-dependent degradation. Using pharmacological JNK inhibitors and activators, we confirmed that this response is mediated by JNK, the primary kinase governing cellular oxidative stress responses. Our data suggest that JNK-mediated phosphorylation serves as the regulatory switch controlling CHFR stability under oxidative conditions.
These findings provide crucial insights into the diverse regulatory mechanisms that enable CHFR’s extensive substrate network throughout the cell. The dual phosphorylation-dependent regulation by ATR and JNK represents a sophisticated cellular strategy for context-dependent CHFR function, allowing precise modulation of its E3 ligase activity in response to different types of cellular stress. This regulatory paradigm may explain how a single E3 ligase can orchestrate such diverse cellular processes while maintaining specificity for appropriate damage response pathways.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

CHFR (a CHeckpoint with FHA and RING domains)은 그 이름이 말해주듯이 체크포인트 단백질이자 암 억제자로 잘 알려져 있다. CHFR의 낮은 발현, 혹은 기능을 상실할 정도의 돌연변이는 암의 발생과 직결되는 것으로 밝혀져 있으며, CHFR은 E3 유비퀴틴화 효소 활성을 바탕으로 PLK1, HDAC1, Aurora A, HLTF, SIRT1 등의 여러 기질 단백질들을 조절함으로써 암 발생의 억제에 기여한다. 그러나 CHFR의 표적 단백질은 암세포화, 혹은 암의 전이에 관련된 것 뿐만 아니라, 세포 주기 조절, 세포 자살에 관련된 단백질 CyclinB1, PLK1, Aurora A, 염증 반응에 연관된 NF-kB, 산화 스트레스에 관련된 SIRT1, 세포 부착연접에 연관된 VE-cadherin에 이르기까지 광범위하다. 그러나 하나의 유비퀴틴화 효소인 CHFR로 하여금 변화하는 세포 환경에 대응하여 이러한 다기능성을 발휘하게끔 하는 메커니즘이 무엇인지는 아직 불투명하며, 따라서 나는 CHFR에게 세포 손상 신호를 전달하고, 세포 손상 대응 기전의 맥락 상에 위치시키는 상위 조절 메커니즘을 밝혀내고자 하였다.
본 연구에서, CHFR은 두 상위 조절자 kinase ATR과 JNK에 의해 조절되어 세포 손상에 대응하는 것으로 밝혀졌다. CHFR은 ATR에 의해 인산화되면 DNA 손상 반응에, JNK에 의해 인산화 되면 산화 손상 반응 경로에 편입되어 기능을 발휘한다. 그러나 같은 인산화 기전에 의한 조절이더라도 어떤 인산화 효소에 의해 조절되는가에 따라 CHFR의 기능은 상반되게 나타난다. CHFR은 ATR에 의해, 또한 ATR에 의해 전달되는 DNA 손상에 의해 인산화 변형된다. 그러나 ATR에 의해 인산화된 CHFR은 JNK에 의해 인산화되었을 때와는 달리 단백질 안정성의 감소가 일어나지 않으며, 심지어는 손상신호가 오지 않았을 때보다도 안정화된다. CHFR의 자가 유비퀴틴화 능력은 감소하고, 대신 세포주기, 특히 분열기의 조절에 중요한 역할을 하는 단백질인 PLK1와의 결합친화도는 증가한다. CHFR의 정확한 인산화 부위 규명을 통해 표적 돌연변이로 CHFR의 인산화 능력을 제거하였을 때, 비가역적으로 손상된 세포의 apoptosis 유도, 나아가 손상된 세포의 생장과 분열을 억제하는 기능이 상실되는 것을 관찰할 수 있었다. PLK1에 대한 CHFR의 조절 능력은 췌장암의 진행에도 중요한 역할을 한다고 알려져 있어, 인산화를 통한 CHFR의 조절은 암 억제자로서의 CHFR의 기능에 필수적인 요소라고 할 수 있다. 반면, 세포에 산화 스트레스가 가해지면 CHFR은 자가유비퀴틴화가 증가하여 프로테아좀 의존적 분해에 의해 단백질 안정성이 크게 감소한다. 이것이 산화 스트레스 반응을 주관하는 인산화 효소인 JNK에 의한 것임을, JNK 저해제와 JNK 활성화제를 통해 각각 검증하였고, JNK에 의해 CHFR이 인산화 조절될 것이라는 가능성을 타진하였다. 결론적으로 이 결과는 세포 전반에 걸쳐 광범위한 기능의 표적 단백질 제어를 가능케하는 CHFR의 다양한 조절 메커니즘의 단서를 밝혀냈다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract …………………………………………………………………… ⅰ
• Table of Contents ………………………………………………………… ⅳ
• List of Figures ……………………………………………………………… ⅶ
• Background ………………………………………………………………… 1
• 1. Ubiquitylation and Proteolysis ………………………………………… 1
• 1-1. Ubiquitin-Proteasome system (UPS) ……………………………… 1
• 1-2. CHFR Ub-ligase …………………………………………………… 4
• 2. Cellular damage response (CDR) ……………………………………… 13
• 2-1. CDR by genotoxic stress (ATR/ATM pathway) ………………… 13
• 2-2. CDR by oxidative stress (JNK pathway) ………………………… 15
• Chapter Ⅰ. CHFR is regulated by ATR signaling upon genotoxic stress …20
• Introduction …………………………………………………………… 21
• Methods and Materials ………………………………………………… 24
• Results …………………………………………………………………… 28
• 1. CHFR interacts with ATR ……………………………………………28
• 2. CHFR is phosphorylated by ATR upon DNA damage ………………33
• 3. CHFR stability remains constant during DNA damage response…… 35
• 4. Auto-ubiquitination of CHFR is impaired upon DNA damage …… 53
• 5. CHFR-PLK1 binding affinity is augmented upon phosphorylation of
• CHFR …………………………………………………………………57
• 6. CHFR phosphorylation enhances its activity as a tumor suppressor… 61
• Discussion………………………………………………………………… 67
• Chapter Ⅱ. CHFR is regulated by JNK signaling upon oxidative stress …72
• Introducton ……………………………………………………………… 73
• Methods and Materials ………………………………………………… 76
• Results …………………………………………………………………… 79
• 1. CHFR interacts with JNK………………………………………………79
• 2. CHFR is destabilized upon oxidative stress ………………………… 82
• 3. Oxidative stress-induced destabilization of CHFR depends on its ubiquitin
• ligase activity ………………………………………………………… 82
• 4. JNK activation induces CHFR destabilization ……………………… 85
• 5. CHFR is phosphorylated and regulated by JNK kinase ………………88
• Discussion …………………………………………………………………101
• Conclusion …………………………………………………………………105
• References ………………………………………………………………… 109
• Abstracts in Korean…………………………………………………………121