Strategies for Rapid Propagation of Gene-Edited Cattle = 유전자 편집 소의 효율적인 확산 전략

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Gene-edited cattle hold great promises for improving agricultural productivity, enhancing animal welfare, producing biopharmaceuticals, and also serving as cellular resources for cell-based food production systems. However, challenges such as the long gestation period, ethical concerns regarding conventional methods like SCNT and intensive maneuvers to edit genome in bovine embryos have limited the rapid advancement of genome editing in cattle. To address these challenges, I aimed to develop and validate simplified embryo engineering methods and investigate the potential in vitro applications of gene-edited cattle.
First, CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein (RNP) electroporation was optimized for bovine zygotes, enabling the efficient generation of double knockout cattle without requiring somatic cell nuclear transfer. Germline transmission of the edited alleles was confirmed through breeding, demonstrating stable inheritance.
Next, site-specific knock-in methods were established by combining electroporation with adeno-associated virus (AAV)-mediated donor delivery, achieving efficient gene insertion without micromanipulation. Furthermore, a micro-sized ubiquitous promoter was isolated from the bovine MSTN gene's regulatory region and refined to allow packaging of an all-in-one AAV carrying a spCas9 gene editing cassette. This system enabled one-step genome editing in bovine embryos, although further improvements in efficiency are needed.
In addition, to provide a reliable cellular platform for downstream applications such as cultured meat or in vitro gametogenesis, I derived and characterized bovine embryonic stem cells (bESCs) under feeder-free conditions. Using Matrigel and mTeSR1-based medium, bESCs were efficiently derived from in vitro-produced blastocysts and maintained for over 30 passages with stable expression of pluripotency markers. The derived lines demonstrated differentiation into all three embryonic germ layers through embryoid body formation, and medium compositions and extracellular matrices were systematically tested to optimize cell proliferation and marker stability. Furthermore, extended potential stem cells (EPSCs) were also derived and partially evaluated for their in vitro totipotency. These findings offer a robust in vitro stem cell system from bovine embryos, which may facilitate both basic developmental research and industrial applications.
Overall, I established streamlined embryo engineering techniques for generating gene-edited cattle. These advances are expected to contribute to the future development of livestock biotechnology, cultured meat production, and gene therapy research using bovine models.

국문 초록 (Abstract)

유전자 편집 소는 농업 생산성 향상, 동물 복지 증진, 바이오의약품 생산, 그리고 세포 기반 식품 생산 시스템을 위한 세포 자원으로서 매우 높은 가능성을 지니고 있다. 그러나 소의 긴 임신 기간, 체세포 핵 이식과 같은 기존 방법에 대한 윤리적 문제, 그리고 소 배아에서의 노동집약적인 유전체 편집 조작 필요성 등으로 인해, 소에서의 유전체 편집 기술 발전은 상대적으로 제한되어왔다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 본 연구에서는 간소화된 배아 공학 기법을 개발하고 검증하는 한편, 유전자 편집 소의 체외에서의 응용 가능성을 평가하고자 하였다.
우선, 소 수정란에 크리스퍼-캐스나인 리보뉴클레오프로테인을 전기천공하여 최적화함으로써, 체세포 핵 이식 없이도 이중 녹아웃 소를 효율적으로 생산하는 데 성공하였다. 편집된 대립유전자의 생식세포 전달이 교배를 통해 확인되어 안정적인 유전이 입증되었다. 다음으로, 전기천공과 아데노-관련 바이러스 매개 전달 방식을 결합하여, 미세조작 없이도 효율적인 위치 특이적 서열 삽입을 달성하였다. 또한, 소 근육 조절인자 유전자의 조절 영역으로부터 소형 범용 프로모터를 분리하고 정제하여, 캐스나인 유전자 편집 카세트를 포함하는 바이러스 시스템을 구축하였다. 이 시스템을 이용하여 소 배아 단계에서 단순 유전자 편집이 가능함을 확인하였으나, 향후 효율 개선이 필요한 것으로 나타났다.
또한, 후속 응용을 위한 안정적인 세포 플랫폼 제공을 목적으로, 피더 세포가 없는 조건에서 소 배반포로부터 프라임 만능성을 보유한 소 배아줄기세포를 분리하고 그 특성을 분석하였다. 배양된 소 배아줄기세포는 30계대 이상 안정적으로 유지되었고, 다형능 마커 유전자를 지속적으로 발현하였다. 형성된 세포주들은 배아 유사체 유도 실험을 통해 외배엽, 중배엽 그리고 내배엽의 삼배엽 분화 가능성을 입증하였다. 또한 확장된 만능성을 보유한 소 배아줄기세포를 배아로부터 분리하여, 소 배아 수준의 키메라 형성, 그리고 인공 배아 형성을 위한 초석을 마련하였다.
본 연구를 통해 유전자 편집 소를 생산하기 위한 배아 공학 기술이 간소화되었으며, 유전자 편집 소를 다양한 in vitro 플랫폼에 활용할 수 있는 실질적 기반이 마련되었다. 이러한 연구 결과는 향후 가축 생명공학, 배양육 생산, 그리고 소 모델을 이용한 유전자 치료 연구의 발전에 기여할 것으로 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT 3
• TABLE OF CONTENTS 5
• LIST OF TABLES 7
• LIST OF FIGURES 8
• LIST OF ABBREVIATIONS 11
• PUBLICATION LISTS 16
• PART I. LITERATURE REVIEW 20
• 1. Significance and Applications of Gene-edited Cattle 21
• 2. Tools for gene (genome) engineering 29
• 3. Delivery methods of genetic engineering tools into Embryos 41
• 4. Objectives of current studies 45
• PART II. GENERAL METHODOLOGY 47
• 1. Primary cell culture 48
• 2. In vitro maturation 48
• 3. In vitro fertilization and in vitro culture of embryo 49
• PART III. STRATEGIES FOR RAPID PROPAGATION OF GENE-EDITED CATTLE 50
• Chapter Ⅰ. Generation and germline transmission of double knockout cattle via CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein (RNP) electroporation. 51
• Introduction 51
• Materials and methods 52
• Results 57
• Discussions 77
• Conclusions 80
• Chapter II. Electroporation-mediated site-specific knock-in methods in bovine embryos. 81
• Introduction 81
• Materials and methods 83
• Results 86
• Discussions 101
• Conclusions 104
• Chapter III. Micro-sized promoter for AAV-mediated gene editing in bovine embryo. 106
• Introduction 106
• Materials and methods 109
• Results 116
• Discussions 143
• Conclusions 147
• Chapter IV. Derivation of bovine pluripotent embryonic stem cells and extended potential stem cells from bovine embryos for in vitro breeding. 148
• Introduction 148
• Materials and methods 149
• Results 159
• FINAL CONCLUSION 196
• REFERENCES 199
• 국문 초록 219