Single-molecule fluorescence studies on the remodeling mechanisms of CHD-family chromatin remodelers = CHD 계열 크로마틴 리모델러의 리모델링 기작에 대한 단일분자 형광 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Living cells undergo nucleosome remodeling to perform essential genetic activities such as transcription, replication, and DNA repair. Chromatin remodelers reposition DNA by disrupting its association with the histone octamer, but the precise mechanism remains unclear. Recent single-molecule studies of ISWI-family remodelers, along with several structural analyses, have strengthened support for the twist diffusion model, in which localized torsional strain propagates through nucleosomal DNA. However, this mechanism has yet to be broadly validated across diverse chromatin remodeler families.

In this study, the remodeling mechanism of Saccharomyces cerevisiae CHD1 (yChd1) was investigated using single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET). A unique feature of yChd1 was identified: ATP binding induces transient unwrapping of nucleosomal DNA on the exit side-a behavior not previously observed in other remodelers. This unwrapping is tightly coupled to nucleosome translocation.
To explore the functional role of this exit-side unwrapping in the remodeling process, chemical step sizes were measured for yChd1 as well as for other CHD-family members, Mus musculus CHD4 (mChd4) and Homo sapiens CHD7. The results reveal that yChd1 translocates nucleosomes in stochastic 4- or 7-base pair steps per ATP hydrolysis event, whereas mChd4 and CHD7 exhibit consistent 2-base pair steps. Domain-swapping experiments between yChd1 and CHD7 further suggest that, although the ATPase domain contributes to step-size determination, additional regions—likely within accessory domains—are required to fully specify translocation behavior.
Together, these findings uncover a previously uncharacterized remodeling mechanism within the CHD family and support the plausibility of a bulge/loop propagation model, in which directional movement of DNA bulges around the histone core enables chromatin remodelers to reposition DNA in steps larger than a single base pair per ATP hydrolysis.

국문 초록 (Abstract)

뉴클레오솜 리모델링(Nucleosome remodeling)은 전사, 복제, DNA 복구 등 주요 세포 과정에 필수적이며, 주로 크로마틴 리모델러(Chromatin remodeler)에 의해 진행된다. 히스톤(histone) 주변의 DNA를 어떻게 재배치하는지를 설명하기 위해 여러 기전적 모델이 제안되어 왔으며, 이 중 twist diffusion 모델과 bulge/loop propagation 모델이 유력한 두 가지 모델로 대두되었다. 최근 ISWI 계열 리모델러에 대한 단일분자 연구와 여러 구조 기반 연구를 통해 twist diffusion 모델에 대한 지지가 강화되었으나, 이 기작이 모든 크로마틴 리모델러 계열 전반에 걸쳐 보편적으로 적용되는지는 아직 입증되지 않았다.
본 연구에서는 Saccharomyces cerevisiae 유래 CHD1 (yChd1)의 리모델링 기작을 단일분자 FRET(single-molecule fluorescence resonance energy transfer, smFRET)을 통해 관찰하였다. 그 결과 yChd1에서만 관찰되는 고유한 특징이 확인되었는데, ATP 결합 시 뉴클레오솜 DNA의 출구 방향(exit-side)에서 일시적인 풀림(unwrapping)이 유도되며, 이는 리모델링 과정의 핵심 단계인 뉴클레오솜 전좌(translocation)와 긴밀히 연계되어 있음이 밝혀졌다.

이 출구 방향의 일시적인 풀림이 DNA 전좌 과정에서 미치는 영향을 규명하고자, yChd1뿐 아니라 동일 CHD 계열의 Mus musculus CHD4(mChd4) 및 Homo sapiens CHD7에 대해서도 ATP 가수분해당 DNA 전좌 거리(chemical step size)를 측정하였다. 그 결과, yChd1은 한 번의 ATP 가수분해당 4 또는 7 염기쌍(bp)만큼 전좌하는 반면, mChd4와 CHD7은 2 염기쌍 스텝을 보이는 것으로 나타났다. 추가적인 yChd1-CHD7 간 도메인 교환(domain swapping) 실험은, ATPase 도메인이 전좌 거리 결정에 영향을 주지만, accessory 도메인 등 다른 영역이 전체적인 전좌 특성을 결정하는 데 필수적임을 시사한다.

종합적으로, 본 연구는 CHD 계열 내에서 이전에 발견되지 않았던 새로운 리모델링 기작을 밝힘과 동시에, ATP 1분자당 1bp 를 초과하는 DNA 전좌가 가능한 bulge/loop propagation 모델의 가능성을 지지하는 근거를 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• Contents iii
• Chapter (1) Introduction 1
• 1.1. Nucleosome and chromatin remodelers 1
• 1.1.1. Chromatin remodelers 1
• 1.1.2. CHD chromatin remodeler 2
• 1.2. Single-molecule experiments 4
• 1.2.1. Fluorescence Resonance Energy Transfer 4
• 1.2.2. Single-molecule fluorescence microscopy 7
• References 9
• Chapter (2) Yeast Chd1p unwraps the exit side DNA upon ATP binding to facilitate the nucleosome translocation occurring upon ATP hydrolysis 12
• 2.1. Introduction 12
• 2.2. Materials and methods 13
• 2.2.1. Protein expression and purification 13
• 2.2.2. DNA and nucleosome preparation 14
• 2.2.3. Single-molecule FRET experiment 15
• 2.3. Results 17
• 2.3.1. Unwrapping of the exit side DNA precedes nucleosome translocation by yeast Chd1p 17
• 2.3.2. ATP binding to Chd1p induces stochastic DNA unwrapping on the exit side 20
• 2.3.3. Translocated DNA on the exit side is rewrapped after the dissociation of phosphate and ADP 26
• 2.3.4. DNA unwrapping on the entry side is not coupled with nucleosome translocation 32
• 2.3.5. DNA Unwrapping on the Exit Side Dictates the Remodeling Speed 35
• 2.4. Conclusion 36
• References 39
• Chapter (3) CHD chromatin remodelers exhibit multi-base-pair chemical step sizes during nucleosome translocation 42
• 3.1. Introduction 42
• 3.2. Materials and methods 44
• 3.2.1. Protein expression and purification 44
• 3.2.2. DNA and nucleosome preparation 46
• 3.2.3. Single-molecule FRET experiment 46
• 3.3. Results 48
• 3.3.1. Kinetic step sizes vary among CHD family chromatin remodelers 48
• 3.3.2. CHD family chromatin remodelers translocate nucleosomes in multi-base-pair elementary steps 53
• 3.3.3. Both the ATPase and regulatory domains influence the elemental nucleosome remodeling step sizes 59
• 3.4. Conclusion 62
• References 65
• Abstract in Korean (국문초록) 67