Proteomic Signatures and Early Biomarkers Predicting Veno-Occlusive Disease in Pediatric Patients Undergoing Haploidentical HSCT with Busulfan-based Conditioning = Busulfan 기반 전처치를 사용하는 반일치 조혈모세포이식을 받은 소아 환자에서 간정맥폐쇄증을 예측하는 혈장 단백체 기반 초기 바이오마커에 관한 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Haploidentical related donor (HRD) is a common alternative donor strategy used when matched sibling or unrelated donors are not available for hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). However, there have been no studies comparing HRD HSCT with post-transplant cyclophosphamide (PTCy) and matched unrelated donor (MUD) HSCT with antithymocyte globulin, using similar busulfan-based myeloablative conditioning regimen in pediatric acute leukemia. Here, we compared the outcomes in children and adolescents with high-risk acute leukemia after HRD HSCT with PTCy (n=35) and MUD HSCT (n=45) after targeted busulfan-based myeloablative conditioning using intensive pharmacokinetic monitoring. The median follow-up times of the HRD and MUD groups were 3.7 and 4.6 years, respectively. No engraftment failure was observed in both groups. The cumulative incidence of acute graft-versus-host disease (GVHD) grades II–IV (34.3% versus 48.9%, p=0.142), grades III–IV (2.9% vs. 8.9%, p=0.272), moderate to severe chronic GVHD (11.4% vs. 18.3%, p=0.417), relapse (25.6% vs. 28.0%, p=0.832), and non-relapse mortality (0% vs. 2.2%, p=0.420) were not significantly different between the two groups. The 3-year severe chronic GVHD-free/relapse-free (GRFS), leukemia-free (LFS) and overall survival (OS) rates in the HRD and MUD groups were 62.9% (95% confidence intervals [CI], 45.8%, 80.0%) versus 49.8% (95% CI, 34.9%, 64.7%; p=0.318), 74.4% (95% CI, 58.7%, 90.1%) versus 67.5% (95% CI, 53.4%, 81.6%; p=0.585), and 88.6% (95% CI, 78.0%, 99.2%) versus 83.7% (95% CI, 72.5%, 94.9%; p=0.968), respectively. In a subgroup analysis of acute lymphoblastic leukemia patients (HRD, n=17; MUD, n=26), the 3-year GRFS, LFS, and OS rates of the HRD and MUD groups were 49.4% (95% CI, 24.3%, 74.5%) versus 39.5% (95% CI, 19.7%, 59.3%; p=0.601), 61.8% (95% CI, 37.5%, 86.1%) versus 63.6% (95% CI, 44.4%, 82.8%; p=0.872), and 82.4% (95% CI, 64.4%, 100%) versus 84.2% (95% CI, 70.1%, 98.3%; p=0.445), respectively. In acute myeloid leukemia patients (HRD, n=16; MUD, n=16), the 3-year GRFS, LFS, and OS rates of the HRD and MUD groups were 80.8% (95% CI, 61.2%, 100%) versus 61.9% (95% CI, 37.8%, 86.0%; p=0.326), 87.1% (95% CI, 70.2%, 100%) versus 73.9% (95% CI, 51.8%, 96.0%; p=0.478), and 93.8% (95% CI, 81.8%, 100%) versus 85.6% (95% CI, 67.0%, 100%; p=0.628), respectively. Although the difference was not statistically significant and the number of patients was small, the promising outcomes of HRD HSCT in AML patients were encouraging. Our results demonstrated that HRD HSCT with PTCy using a targeted busulfan-based myeloablative conditioning shows outcomes similar to those of MUD HSCT with antithymocyte globulin. HRD HSCT with PTCy could be a feasible option for pediatric high-risk acute leukemia patients who lack an HLA-matched related or unrelated donor.

Introduction: Hepatic veno-occlusive disease (VOD), or sinusoidal obstruction syndrome, is a life-threatening complication following hematopoietic cell transplantation (HSCT). In pediatric patients, busulfan-based myeloablative conditioning is a major risk factor. This study aimed to identify plasma proteomic biomarkers predictive of VOD development in children undergoing haploidentical HSCT with busulfan-based conditioning and post-transplant cyclophosphamide.
Methods: Plasma samples were collected from 51 children (VOD, n=26; control, n=25) at baseline and 1–4 hours post-busulfan infusion on days -8 to -5. Proteomic profiles using liquid chromatography-tandem mass spectrometry identified 720 proteins. Differential abundance, longitudinal clustering, pathway enrichment, and machine learning-based biomarker selection were performed.
Results: The VOD group exhibited predominantly down-regulated proteins, with minimal changes from baseline during early treatment. Pathway enrichment analysis revealed distinct temporal patterns between the groups. At baseline, the VOD group showed enrichment in homeostasis-related pathways, while detoxification pathways were persistently activated post-conditioning. In contrast, the control group demonstrated early activation of detoxification pathways, which gradually declined, suggesting effective oxidative stress management. A machine learning model, trained on a discovery cohort (70%) and 30% validated on a separate cohort (30%), identified 15 biomarkers. Notably, glutamate-cysteine ligase catalytic subunit (GLCL), crucial for glutathione biosynthesis, and fructose-bisphosphatase 1 (FBP1), a gluconeogenic enzyme, were down-regulated at baseline in the VOD group.
Conclusion: Baseline down-regulation of proteins such as GLCL and FBP1 may serve as early biomarkers for predicting VOD, facilitating timely prophylactic interventions in high-risk pediatric patients undergoing haploidentical HSCT with busulfan-based conditioning and post-transplant cyclophosphamide.

국문 초록 (Abstract)

배경: 반일치 조혈모세포이식(haploidentical related donor, HRD)은 조
직적합항원(HLA)이 일치하는 형제 공여자나 비혈연 공여자가 없는 소
아 환자에서 조혈모세포이식(hematopoietic stem cell transplantation,
HSCT)의 효과적인 대안으로 각광받고 있다. 하지만 특히 부설판
(busulfan)을 이용한 골수제거성 전처치(myeloablative conditioning)
를 시행하는 경우 중증의 합병증인 간정맥폐쇄병증(veno-occlusive
disease, VOD)의 위험이 증가할 수 있다. 따라서 신뢰성 있는 바이오마
커를 통해 VOD의 발생을 조기에 정확히 예측하는 것은 환자의 임상적
관리와 예후를 향상시키는 데 매우 중요하다. 그러나 임상적으로 유용한
VOD 예측 바이오마커는 여전히 부족한 실정이므로, 이에 대한 연구가
필수적이다.

방법: 본 연구는 소아 고위험 급성 백혈병 환자 중 HRD HSCT 후 이식
후 사이클로포스파마이드(post-transplant cyclophosphamide, PTCy)
를 투여받은 군(n=35)과, 항흉선글로불린(antithymocyte globulin)을
사용한 HLA 일치 비혈연 공여자(matched unrelated donor, MUD)
HSCT 군(n=45)의 임상적 결과를 후향적으로 비교하였다. 두 군 모두
목표 혈중 농도 조절을 위한 집중적 약동학 모니터링을 동반한 부설판
기반의 골수제거성 전처치를 시행받았다. 또한, 전향적 코호트 연구를
통해 HRD HSCT를 시행한 소아 환자 51명(VOD군 26명, 대조군 25
명)의 혈장 검체를 전처치 시작 전 기저 시점과 부설판 투여 직후에 연
속적으로 수집하였다. 혈장 프로테오믹스 분석은 액체크로마토그래피질량분석법(LC-MS/MS)을 이용하여 수행되었으며, 단백질 발현 변화
분석, 종단적 클러스터링, 생물학적 경로 분석, 기계학습을 활용한 바이
오마커 발굴 및 검증이 진행되었다.
결과: 후향적 비교 분석에서 HRD HSCT와 MUD HSCT 두 군은 전체
생존율, 백혈병 무사건 생존율, 중등증 이상의 만성 이식편대숙주병
(GVHD) 없는 재발 없는 생존율에서 유의한 차이가 없었으며, 급성
GVHD 등급 II-IV, 만성 GVHD, 재발률 및 비재발사망률에서도 통계적
으로 유의한 차이는 없었다. 그러나 HRD HSCT 군에서 VOD의 발생률
이 높게 나타나, 조기 예측 및 예방적 접근의 임상적 중요성이 부각되었
다. 프로테오믹스 분석에서는 VOD가 발생한 환자군에서 기저 시점부터
해독 및 산화 스트레스 대응 경로에 관련된 단백질, 특히 glutamatecysteine ligase catalytic subunit(GLCL)와 fructose-bisphosphatase
1(FBP1)의 발현이 현저히 감소된 것으로 나타났다. 경로 분석에서는
VOD군이 스트레스 반응 경로가 지속적으로 활성화된 반면, 대조군은
초기에 효과적인 해독 경로가 활성화되어 이후 점진적으로 감소하는 양
상을 보였다. 기계학습 모델을 통해 15개 단백질을 이용한 예측 바이오
마커 패널을 도출하였으며, 이는 VOD의 조기 예측에 높은 정확도를 나
타냈다.

결론: PTCy를 사용하는 HRD HSCT는 부설판 기반의 골수제거성 전처
치 시행 시 기존의 MUD HSCT와 유사한 임상 결과를 보이지만, 간정
맥폐쇄병증의 위험이 증가하였다. 혈장 프로테오믹스 분석을 통해
GLCL과 FBP1 등 VOD를 조기에 예측할 수 있는 중요한 바이오마커를
발굴하였다. 이 바이오마커들을 임상에 활용하면 고위험군 소아 환자의
조기 예방적 치료가 가능하여, 반일치 조혈모세포이식의 안전성과 치료
성공률을 향상시킬 수 있을 것이다. 향후 다기관 검증 연구와 다중 오믹
스 분석 통합 연구가 추가로 필요하다.
* 본 내용의 일부는 Transplantation and Cellular Therapy 학술지
(Kyung Taek Hong et al. Transplant Cell Ther. 2022
Apr;28(4):195.e1-195.e7. DOI: 10.1016/j.jtct.2022.01.002)에 출판 완료된 내용임.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT i
• CONTENTS iv
• LIST OF TABLES vi
• LIST OF FIGURES vii
• LIST OF ABBREVIATIONS viii
• PART I １
• 1. Abstract ２
• 2. Introduction ４
• 3. Methods ６
• 3.1 Patients ６
• 3.2 Donor selection and stem cell source ６
• 3.3 Transplantation protocol ７
• 3.4 Definition ８
• 3.5 Statistical analyses ８
• 4. Results １０
• 4.1 Patient characteristics １０
• 4.2 Engraftment, Complications, and GVHD １３
• 4.3 Relapse, NRM, and survival １８
• 4.4 Subgroup analysis of ALL, AML ２６
• 5. Discussion ３１
• PART II ３４
• 1. Abstract ３５
• 2. Introduction ３７
• 3. Materials and Methods ３９
• 3.1 Clinical cohorts ３９
• 3.2 Sample preparation ４０
• 3.3 Data-independent acquisition (DIA) - mass spectrometry (MS) analysis ４１
• 3.4 Proteomic data processing ４２
• 3.5 Statistical and bioinformatics Analysis ４２
• 3.6 Machine learning-based biomarker selection ４３
• 3.7 Survival Analysis ４４
• 4. Results ４６
• 4.1 Distinct Proteomic Profiles in VOD and Control Patients Following HSCT with Busulfan-Based Conditioning ４６
• 4.2 Differential Abundance Analysis Between VOD and Control Groups Across Pre- and Post-Conditioning Timepoints ５６
• 4.3 Dynamic Trajectories of Plasma Proteomic Changes During Busulfan Conditioning ６６
• 4.4 Identification of Baseline Biomarkers Predictive of VOD Before Busulfan Conditioning ７４
• 5. Discussion ８４
• CONCLUSION ８９
• REFERENCES ９０
• ACKNOWLEDGEMENTS １０４
• 국문 초록 １０５