N6-methyladenosine modification of HCMV IE1 transcripts accelerates latency establishment via epigenetic regulation of the viral genome = 인간거대세포바이러스의 IE1 전사체의 RNA 아데노신 메틸화 (m?A) 변형에 의한 잠복기 조절기전에 대한 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Human cytomegalovirus (HCMV) is a prevalent pathogen that chronically infects the majority of human population. Among the many features that allow such widespread HCMV infection, one is its ability to maintain a transcriptionally dormant immune-evasive state called latency by suppressing its own major immediate early promoter (MIEP) via epigenetic alterations. In this study, I show a novel mechanism of MIEP regulation in which the major immediate early (MIE) gene product, immediate early 1 (IE1) transcript, downregulates its own promoter activity in an m⁶A modification-dependent manner. I found that the loss of the m⁶A writer, METTL3, in host cell impedes latency establishment in these cells. Through transcriptome-wide m⁶A profiling of latently infected monocytes, I identified that the major immediate early gene product IE1 transcript is m⁶A-modified during latent infection. Using an IE1-specific m⁶A-abolished mutants, I found that m⁶A modification of the IE1 transcript was necessary for the efficient repression of MIEP, and these mutant viruses exhibited significant defect in establishing latency and progressed toward lytic-like infection in the human monocytic cell line THP-1 and primary CD14+ monocytes. My findings demonstrate that HCMV exploits the host m⁶A machinery to suppress its own lytic program to establish latency and uncover an unexpected role of immediate early gene messenger RNA (mRNA) in regulating its own expression.

국문 초록 (Abstract)

인간거대세포바이러스 (HCMV)는 대부분의 인구에게 만성적으로 감염되는 흔한 병원체이다. HCMV가 이렇게 널리 퍼질 수 있는 여러 특징 중 하나는, 자신의 주요 즉각 초기 프로모터(MIEP)를 후성유전학적 조절을 통해 억제함으로써 전사적으로 비활성화된 면역 회피 상태인 잠복감염 상태를 유지할 수 있다는 점이다. 본 연구에서는 HCMV의 주요 즉각 초기 유전자(MIE) 산물인 IE1 전사체가 m⁶A 변형 여부에 따라 음성 피드백을 통해 프로모터의 활성을 억제하는 새로운 조절 기전을 제시한다. 숙주 세포에서 m⁶A 변형 생성 효소인 METTL3가 결실될 경우 바이러스의 잠복 확립이 방해된다는 사실을 발견했다. 잠복 감염된 세포에서 m⁶A 변형된 바이러스 전사체에 대하여 조사한 결과 IE1 전사체가 잠복감염 동안 m⁶A 변형되어 있음을 확인했다. 또한, IE1 전사체 특이적으로 m⁶A 변형이 일어나지 않는 돌연변이 바이러스를 이용하여, IE1 전사체의 m⁶A 변형이 MIEP의 효과적인 억제를 위해 필수적이며, 이러한 m⁶A 돌연변이 바이러스는 잠복 확립에 결함을 보이고, 잠복 감염 모델 세포주뿐만 아니라 실제 잠복감염을 일으키는 인체 유래 단핵구 세포에서 용균성 감염 양상을 보인다는 사실을 확인했다. 이러한 결과는 HCMV가 숙주의 m⁶A 변형 기전을 이용하여 자신의 용균성 유전자 발현을 억제하고, 잠복을 확립한다는 사실을 보여주며, IE1 전사체가 자신의 발현을 조절하는 역할을 수행함을 새롭게 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• Table of Contents
• CONTENTS I
• LIST OF TABLES AND FIGURES IV
• LIST OF ABBREVIATIONS VII
• 1. ABSTRACT 1
• 2. INTRODUCTION 3
• 2.1. Human cytomegalovirus Latency 3
• 2.2. Epigenetic repression of the HCMV major immediate early promoter (MIEP) during latency 6
• 2.3. m⁶A modification and HCMV latency 8
• 3. MATERIALS AND METHODS 9
• 3.1. Cell culture 9
• 3.2. Virus propagation and titration 9
• 3.3. HCMV infection 10
• 3.4. Generation of IE1-m⁶A-abolished mutant virus 11
• 3.5. Generation of METTL3-knockdown cells using lentiviral system 11
• 3.6. Measurement of viral RNA and DNA via qRT-PCR 12
• 3.7. Immunoblotting 13
• 3.8. RNA stability assay 13
• 3.9. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) and qPCR (ChIP-qPCR) 14
• 3.10. Methyl-RNA immunoprecipitation (MeRIP)-seq and qPCR (MeRIP-qPCR) 14
• 3.11. Gene expression analysis 16
• 3.12. RNA immunoprecipitation 16
• 3.13. Co-immunoprecipitation 17
• 3.14. Data deposition 17
• 4. RESULTS 19
• 4.1. m⁶A modification facilitates the establishment of HCMV latency 19
• 4.2. MIE transcript is m⁶A-modified during latency 30
• 4.3. m⁶A modification affects histone modification of MIEP and alters MIE gene expression 44
• 4.4. m⁶A modification of IE1 transcripts facilitates the establishment and maintenance of latency 54
• 4.5. m⁶A modification of IE1 transcripts represses MIEP activity through modulation of histone modifications 68
• 4.6. m⁶A modification of IE1 transcripts iscrucialfor latency establishment in primary CD14+ monocytes 82
• 5. DISCUSSION 88
• 6. REFERENCES 94
• 7. ABSTRACT IN KOREAN 103
• 8. APPENDICS 104