Molecular Basis of Multiple Insecticide Resistance Mechanisms in the Common Bed Bug, Cimex lectularius (Hemiptera: Cimicidae) = 빈대의 다양한 살충제 저항성 기작에 대한 분자생물학적 분석

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The resurgence of Cimex lectularius has been accompanied by increasing levels of insecticide resistance, particularly to pyrethroids, which poses a significant challenge to effective pest management. Beyond resistance to specific target insecticides, there is growing concern that resistant bed bug populations may develop cross-resistance to insecticides with different modes of action, thereby limiting the efficacy of alternative treatments and combination products. A deeper understanding of the molecular mechanisms driving both resistance and cross-resistance is therefore essential to inform sustainable control strategies.
This study evaluated cross-resistance levels in two pyrethroid-resistant strains of C. lectularius against ten non-pyrethroid insecticides, revealing substantial resistance to dinotefuran, a neonicotinoid insecticide. To elucidate the underlying mechanisms, an integrated analysis of toxicodynamic and toxicokinetic pathways was conducted. Target-site insensitivity was assessed by screening for known and novel knockdown resistance (kdr) mutations in the voltage-sensitive sodium channel (VSSC), confirming the presence of V419L and L925I mutations in both resistant strains. Toxicokinetic investigations focused on metabolic detoxification, with synergist bioassays indicating that cytochrome P450 monooxygenases (P450s) and esterases (ESTs) play key roles in deltamethrin metabolism.
A total of 42 P450 and 24 EST genes were profiled for expression across whole-body and tissue-specific samples in resistant and susceptible strains. Differential expression analysis identified candidate detoxification genes, which were functionally validated using RNA interference (RNAi) and fluorescence in situ hybridization (FISH). RNAi-mediated knockdown confirmed the involvement of specific P450 genes in resistance to both deltamethrin and dinotefuran. FISH localized the expression of these candidate genes to the cuticle, suggesting that cuticle-based metabolic activity is a critical site of resistance.
Collectively, these findings provide molecular and functional evidence that cross-resistance in bed bugs is mediated by spatially regulated expression of metabolic genes, highlighting the importance of both tissue-specific detoxification and structural barriers in the evolution of insecticide resistance.

국문 초록 (Abstract)

빈대 (C. lectularius)의 전세계적인 재확산은 특히 피레스로이드계 살충제에 대한 저항성 증가와 함께 나타났으며, 효과적인 방제에 대한 도전 과제로서 제기되고 있다. 이는 단순히 특정 살충제에 대한 저항성을 넘어, 저항성 빈대 개체군이 작용 기작이 다른 살충제에 대해서도 교차저항성을 발달시킬 수 있다는 우려가 커지고 있으며, 이는 대체 살충제의 효능을 제한할 수 있다. 따라서 저항성과 교차저항성을 유도하는 분자 기작에 대한 심층적인 이해는 지속 가능한 방제 전략 수립에 필수적이다.
본 연구는 2계통의 피레스로이드 저항성 빈대를 대상으로 10종의 다른 살충제에 대한 교차저항성을 평가하였으며, 이 중 네오니코티노이드계 살충제인 디노테퓨란에 대한 높은 교차저항성이 확인되었다. 이러한 교차저항성의 기전을 밝히기 위해, toxicodynamic과 toxicokinetic 기작에 대한 통합적 분석을 수행하였다. 피레스로이드계 살충제의 작용기로 알려진 voltage-sensitive sodium channel (VSSC)에서의 knockdown resistance (kdr) 돌연변이를 분석하였으며, 결과적으로 두 저항성 계통 모두 V419L 및 L925I 돌연변이가 확인되었다. Toxicokinetic 분석은 대사 해독 경로를 초점에 맞추었으며, 억제제를 협력제로서 진행한 생물건정을 통해 cytochrome P450 monooxygenases (P450s) 및 esterases (ESTs)가 살충제 대사에 중요한 역할을 하는 것으로 확인하였다. 따라서 총 42개의 P450 유전자와 24개의 EST 유전자에 대하여 빈대의 전신, 부위별 및 조직 특이적 샘플을 대상으로 발현 분석을 수행하였다. 그 결과 저항성에 크게 관여하는 것으로 추측되는 후보 유전자를 선출하였으며, RNA interference (RNAi)에 의한 발현 억제를 통해 후보 P450 유전자가 델타메스린 및 디노테퓨란의 교차저항성과 관련이 있음을 확인하였다. 추가적으로 후보 P450와 함께 EST 유전자에 대해 fluorescence in situ hybridization (FISH) 실험 결과 이들이 큐티클 부위에 발현되는 것으로 나타났으며, 이는 큐티클에서 대사 활성을 통한 저항성의 주요 기작 부위인 것으로 확인되었다.
이러한 결과는 교차저항성이 대사 유전자의 조직 특이적 발현에 의해 매개되는 분자적 및 기능적 근거를 제공하며, 해독 효소의 공간적 발현 조절뿐만 아니라 구조적 장벽의 중요성이 빈대의 살충제 저항성 진화에서 핵심적인 역할을 함을 강조한다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• Chapter 1. Characterization of insecticide resistance in three bed bug strains via bioassays 1
• Abstract 1
• 1. Introduction 3
• 2. Material and Methods 6
• 2.1 Bed bug preparation 6
• 2.2 Chemicals 6
• 2.3 Bioassays 7
• 2.4 Synergistic bioassays 8
• 2.5 Triton X-100 bioassays 9
• 2.6 Statistics 10
• 3. Results 10
• 3.1 Cross-resistance profiles in pyrethroid and non-pyrethroid insecticides 10
• 3.2 Synergistic effects mediated by metabolic enzymes 15
• 3.3 Contribution of cuticular penetration to deltamethrin resistance 23
• 4. Discussion 26
• Chapter 2. Toxicodynamic and toxicokinetic characterization of deltamethrin and dinotefuran resistance 30
• Abstract 30
• 1. Introduction 32
• 2. Material and Methods 36
• 2.1 Bed bug strains 36
• 2.2 Identification of kdr mutations 36
• 2.3 Cloning of full-length vssc gene 37
• 2.4 RNA extraction, cDNA synthesis, and real-time quantitative PCR (qPCR) 40
• 2.5 Tissues preparation 51
• 2.6 Statistics 51
• 3. Results 52
• 3.1 Fixed kdr mutations and absence of additional substitutions in vssc 52
• 3.2 Upregulation of Clan 3 and Clan 4 P450 genes in resistant bed bugs based on whole-body samples 55
• 3.3 Spatial expression patterns of candidate P450 and EST genes in resistant bed bugs based on dissected body parts 60
• 3.4 Cuticle-specific expression of candidate P450 and EST genes in resistant bed bugs 63
• 4. Discussion 67
• Chapter 3. Histochemical and functional validation of metabolic resistance factors 73
• Abstract 73
• 1. Introduction 75
• 2. Material and Methods 77
• 2.1 Bed bug preparation 77
• 2.2 RNAi 77
• 2.3 FISH 82
• 3. Results 85
• 3.1 RNAi-mediated suppression of candidate P450 gene expression 85
• 3.2 Enhanced mortality following RNAi suppression of candidate P450 genes under deltamethrin and dinotefuran exposure 87
• 3.3 Spatial localization of candidate gene expression in the cuticle and CNS 91
• 4. Discussion 97
• Bibliography 101
• Abstract in Korean 105