Mechanistic Elucidation of the Autophagic N-degron Pathway and Protein Arginylation in Innate Immunity = 선천 면역에서 자가포식 N-말단 분해 경로와 단백질 아르기닌화의 분자 기전 규명

국문 초록 (Abstract)

N-말단 분해 경로는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템 (USP)과 자가포식-리소좀 시스템 (ALS)을 통해 다양한 세포 구성 요소를 선택적으로 분해시키는 이화작용 기전이다. R-전달효소 ATE1에 의해 이루어지는N-말단 아르기닌화는 단백질 기질을 불안정화하여 즉각적인 유비퀴틴화와 프로테아좀을 통한 분해를 유도한다. ALS에서의 아르기닌-N-데그론 (Arg/N-degron)은, 다양한 종류의 기질을 세포질에서 격리하고 자가포식 경로로 전달함으로써, 선택적 자가포식에서 주요한 역할을 수행한다. 자가포식-N-말단 분해 경로는 소포체, 미토콘드리아, 퍼옥시좀, 지방소립, 등과 같은 세포 소기관의 항상성 유지에 관여하는 것으로 알려져 있지만, 선천 면역에서의 항상성 유지 역할과 그 분자 기전에 대해서는 아직 명확히 규명되지 않았다.
제 1장에서는, 세포의 이화작용 체계와 N-말단 분해 경로에 대한 일반적인 내용을 소개한다. 두 개의 주요 시스템인 UPS와 ALS는 세포의 항상성 유지를 위해 협업하며 세포의 스트레스 및 손상을 효율적으로 관리하기 위해서 긴밀하게 상호작용한다. N-말단 분해 경로는 두 종류의 N-말단 인식 단백질 (N-recognin), E3 연결 효소와 자가포식 수용체를 이용하여, N-말단 잔기를 선택적으로 인식하여 N-데그론을 분해한다. 자가포식 N-recognin인 p62/SQSTM1은 주로 Arg/N-degron을 자가포식소체에 전달하는 역할을 하며, 그와 동시에 p62 과 Arg/N-degron은 별개의 복합체를 형성하여 자가포식소체의 생합성을 촉진하고, 결과적으로 특정 스트레스 조건에서의 자가포식 분해능을 향상시킨다.
제 2 장에서는, 선천 면역에서 N-말단 분해 경로의 역할에 대해 설명하며, 프로테아좀 기능 장애로 유도된 무균 면역 모델에서 선천 면역 반응의 활성화와 해소에 대한 분자 기전을 제시한다. 프로테아좀 억제는 cGAS-STING 신호 전달 경로를 통해서 1형 인터페론 (IFN)과 인터페론 자극 유전자 (ISG)의 발현을 유도한다. 미토콘드리아 DNA (mtDNA)는 프로테아좀 억제에 의해 세포질로 유출되면 cGAS-STING 신호 전달을 활성화한 후에 자가포식-N-말단 분해 경로를 통해 분해된다. 세포질 mtDNA의 분해 경로는 ATE1과 상호작용하는 DNA-PK에 의해서 활성화되며, 이는 면역 반응의 활성화와는 독립적인 기전이다. DNA-PK는 ATE1을 활성화하고, 소포체에서 세포질로 이동한 BiP/GRP78의 N-말단 아르기닌화가 유도된다. 아르기닌화된 BiP (R-BiP)은 trans-Arg/N-degron으로써 기능하여, 세포질 mtDNA를 자가포식소체로 전달하고 리소좀을 통한 분해를 촉진한다. 결과적으로, 자가포식-N-말단 분해 경로는 세포질 mtDNA의 양을 조절하는 음성 되먹임 고리를 형성하고, 이를 통해 선천 면역 반응의 해소를 촉진하고 과도한 면역을 방지한다. 본 연구 결과는 단백질 독성에 의한 선천 면역의 분자 기전을 규명하고 무균 면역 반응의 맥락에서 N-말단 분해경로의 생리학적 역할을 제시한다.
제 3장에서는, 세포질 DNA가 ATE1에 의한 BiP 아르기닌화를 유도하기에 충분함을 근거로 하여, BiP 아르기닌화의 분자 기전을 규명한다. BiP 은 세포질 DNA에 반응하여, 아르기닌화가 일어나기 전에 소포체에서 세포질로 이동했다. 이 이동 과정에는 막에 구멍을 형성할 수 있는 BAK이 관여한다. 다음으로, ATE1의 조절 기전을 자세히 조사하기 위해서, BiP 아르기닌화 시험 기법을 구축했다. 해당 기법을 활용하여 ATE1 활성에 주요한, 진화적으로 보존된, 세 개의 잔기를 규명했고, ATE1의 1A7A, 1A7B 동형 단백질이 BiP 아르기닌화에 중요하다는 것을 증명하였으며, 1A엑손의 KGL 모티프와 1B 엑손의 N-말단 부분이 각각 독특한 방식을 통해 BiP인식과정을 조절할 수 있음을 제시한다. 종합하면, 본 연구 결과는 BiP 아르기닌화에 대한 구체적인 분자 기전을 제시하며, 효소 활성과 기질 인식을 담당하는 ATE1의 주요 모티프를 규명함으로써, 단백질 아르기닌화 기전에 대한 통찰을 제공한다.
제 4장과 5장에서는, 본 연구에 대한 요약과 한계점 및 향후 방향성에 대한 논의가 이루어지며, 실험 설계와 방법, 재료에 대한 세부사항을 설명한다. 아직 규명되어야 할 연결고리나 해소되어야 할 질문들이 남아있지만, 본 연구는 선천 면역에서N-말단 분해 경로의 병리생리학적 중요성을 강조하며, 만성 염증, 자가면역 질환, 노화, 노화 관련 질병에 대한 잠재적 치료 표적으로서의 가능성을 제시한다. 게다가, BiP 아르기닌화 기전을 규명함으로써 ATE1및 아르기닌화의 조절 기전을 이해하는 활로를 제공하였으며, 더 나아가 단백질 아르기닌화의 생리적 중요성을 확장하고 ATE1 활성 조절을 위한 도구 개발에 기여한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The N-degron pathway is a catabolic mechanism through which a wide range of cellular components are selectively degraded via the ubiquitin-proteasome system (UPS) and the autophagy-lysosome system (ALS). N-terminal arginylation, mediated by the R-transferase ATE1, destabilizes protein substrates by rapidly directing the resulting Arg/N-degrons to ubiquitination and proteasomal degradation. In the ALS, the Arg/N-degron plays a role in selective autophagy by facilitating the delivery and sequestration of various types of cargo. The autophagic N-degron pathway has been implicated in maintaining the homeostasis of subcellular organelles, including the ER, mitochondria, peroxisomes, and lipid droplets; however, its homeostatic role and molecular mechanism in innate immunity remain to be elucidated.
In Chapter 1 of this dissertation, I provide a general introduction to cellular catabolic systems and the N-degron pathway. Two major systems, the UPS and ALS, work together to maintain cellular homeostasis and closely interact to effectively manage cellular stress and damage. The N-degron pathway utilizes two types of N-recognins, E3 ligases and autophagy receptors, which selectively recognize N-terminal residues to degrade N-degrons. The autophagic N-recognin p62/SQSTM1 primarily delivers Arg/N-degrons to autophagosomal membranes, while the Arg/N-degron-bearing p62 concurrently promotes autophagosome biogenesis, thereby enhancing autophagic degradation under stress conditions.
In Chapter 2, I describe the role of the N-degron pathway in innate immunity and present the molecular mechanisms underlying the activation and resolution of innate immune responses in a sterile immunity model induced by proteasomal dysfunction. I show that proteasome inhibition induces the expression of type I interferon (IFN) and interferon-stimulated genes (ISGs) via the cyclic GMP-AMP synthase (cGAS)-stimulator of interferon genes (STING) pathway. Cytosolic mitochondrial DNA (mtDNA), which is released in response to proteasome inhibition, triggers the immune response and is subsequently degraded through the autophagic N-degron pathway. Independent of immune response activation, the mtDNA degradation pathway is initiated by DNA-dependent protein kinase (DNA-PK), whose DNA-binding subunit, KU70, interacts with ATE1. DNA-PK-mediated activation of ATE1 induces N-terminal arginylation of BiP/GRP78 after its translocation from the endoplasmic reticulum (ER) to the cytosol. Cytosolic arginylated BiP (R-BiP), acting as a trans-Arg/N-degron, delivers cytosolic mtDNA to autophagosomes to facilitate its lysosomal degradation. Consequently, the autophagic N-degron pathway establishes a negative feedback loop that regulates cytosolic levels of mtDNA, thereby promoting the resolution of innate immune responses and preventing excessive immunity. My results demonstrate the molecular mechanisms of innate immunity under proteotoxic stress and suggest a physiological role of the N-degron pathway in the context of sterile immune responses.
In Chapter 3, I elucidate the molecular mechanisms underlying the arginylation of BiP, based on the finding that cytosolic DNA is sufficient to induce BiP arginylation by ATE1. I show that BiP translocates from the ER to the cytosol in response to DNA transfection, before undergoing arginylation. This translocation is mediated by BAK, which is capable of forming membrane pores. To further investigate the regulatory mechanism of ATE1 activity, I established a BiP arginylation assay to assess the ATE1-dependent arginylation by monitoring R-BiP levels. My results identify three evolutionarily conserved residues that are critical for ATE1 enzymatic activity, and demonstrate that ATE1 isoforms, including 1A7A and 1A7B, are responsible for the BiP arginylation. For BiP recognition, the KGL motif in exon 1A and the N-terminal region in exon 1B exhibit distinct regulatory roles, suggesting that exon 1 may determine the substrate specificity of ATE1. Together, these findings reveal the molecular mechanisms underlying BiP arginylation in response to cytosolic DNA and identify key motifs in ATE1 responsible for its enzymatic activity and substrate recognition.
In Chapters 4 and 5, I summarize and discuss the results of this dissertation and provide detailed descriptions of the experimental design, protocols, and materials. Although some missing links and questions remain to be addressed in future studies, the findings presented in this dissertation highlight the pathophysiological importance of the N-degron pathway in innate immunity and suggest that it could serve as a potential therapeutic target for chronic inflammation, autoimmune diseases, aging, and aging-related diseases. Furthermore, molecular elucidation of BiP arginylation paves the way for understanding the regulatory mechanism of ATE1 and protein arginylation, thereby expanding the known physiological significance of arginylation and facilitating the development of tools to modulate ATE1 activity.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• Contents v
• List of Figures viii
• List of Abbreviations xv
• Chapter 1. General Introduction 1
• Chapter 2. The mechanism and function of the N-degron pathway in sterile immunity 14
• Introduction 15
• Results 20
• Proteasomal dysfunction induces sterile immune responses via the cGAS-STING pathway 20
• Mitochondrial DNA is released into the cytosol upon proteasomal dysfunction 22
• The sterile immune response to proteasomal dysfunction is mediated by the cytosolic mtDNA 24
• The N-degron pathway mediates the autophagic degradation of the cytosolic mtDNA 26
• Cytosolic mtDNA induces the N-degron pathway to form a negative feedback loop of self-destruction 29
• DNA-PK is required for ATE1-mediated BiP arginylation 31
• The negative feedback loop via the DNA-PK-ATE1 pathway modulates the sterile immune responses 33
• Discussion 35
• Chapter 3. The molecular mechanisms underlying the Nt-arginylation of endoplasmic reticulum-residing chaperones 108
• Introduction 109
• Results 113
• BiP translocates into the cytosol through BAK in response to cytosolic DNA 113
• The functional regions of human ATE1 for BiP arginylation are identified through a BiP arginylation assay 114
• DNA-PK may phosphorylate non-canonical threonine residues of ATE1 115
• The exon 1A of ATE1 is responsible for the BiP recognition 116
• Discussion 119
• Chapter 4. Overall Discussion and Conclusion 141
• Chapter 5. Materials and Methods 148
• Cell culture and human cell lines 149
• Antibodies and nucleic acids 149
• Generation of the mtDNA depleted (ρ0) cell line 152
• HSV-1 propagation 152
• Cloning and site-directed mutagenesis 153
• Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Immunoblotting 154
• IRF3 dimerization assay 154
• Transfection of nucleic acids 155
• Co-Immunoprecipitation (Co-IP) 156
• Immunocytochemistry (ICC) 156
• RNA extraction and RT-PCR analysis 157
• Isolation of cytosolic fractions 158
• HSV-1 titration and Plaque forming Unit (PFU) assay 158
• Sample preparation for interactome analysis 159
• Mass spectrometry analysis 160
• Data processing 160
• Quantification and statistical analysis 161
• References 162
• Abstract in Korean 183