Genome-wide profiling of transcription factors essential for survival and virulence of Vibrio vulnificus = 비브리오패혈증균의 생존 및 독성에 필수적인 전사조절자들의 유전체 수준 분석

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

To establish a successful infection, bacterial pathogens recognize environmental signals and elaborately regulate the expression of survival and virulence genes within the host using various transcription factors (TFs). In the present study, the functions of entire TFs in the life-threatening bacterial pathogen Vibrio vulnificus were comprehensively profiled. Then, TFs essential for survival and virulence were identified as potential targets to control the V. vulnificus pathogenicity and their regulatory functions were further characterized. In detail, a library of the V. vulnificus mutants carrying specific signature tags in 285 TF genes was constructed and subjected to 16 phenotypic analyses. Consequently, 89 TFs affecting more than one phenotype of V. vulnificus were identified. Of these, 59 TFs affect the in vitro survival including growth, stress resistance, biofilm formation, and motility, and 64 TFs affect the virulence of V. vulnificus. At first, CarR, among the 59 TFs, was found to develop resistance to polymyxin B, a cationic antimicrobial peptide. Given that V. vulnificus shows intrinsic resistance to polymyxin B, CarR could be a potential drug target to improve the efficacy of the antimicrobial peptide through a synergistic effect. CarR was identified as a response regulator of the CarRS two-component system (TCS) with its cognate sensor kinase CarS. Transcriptome analysis revealed that CarR strongly activates the expression of the eptA, tolCV2, and carRS operons. In particular, the eptA operon plays a major role in developing the CarR-mediated polymyxin B resistance. Phosphorylation of CarR by CarS is required for the regulation of its downstream genes, leading to the polymyxin B resistance. Nevertheless, CarR directly binds to specific sequences in the regulatory regions of the eptA and carRS operons, regardless of its phosphorylation. Notably, the CarRS TCS alters its own activation state by responding to several environmental stresses, including polymyxin B, divalent cations, bile salts, and pH change. Furthermore, CarR modulates the resistance of V. vulnificus to bile salts and acidic pH among the stresses, as well as polymyxin B. The combined results suggested that the CarRS TCS, in responding to multiple host environmental signals, could provide V. vulnificus with the benefit of surviving within the host by enhancing its optimal fitness during infection. Finally, 27 of the 64 TFs affecting the virulence of V. vulnificus were found to enhance the in vitro hemolytic or cytotoxic activities and 8 TFs of them were also found to increase the in vivo brine shrimp or murine infectivities of the pathogen. Of the eight TFs, HlyU, IscR, NagC, MetJ, and Tet2 were shown to not affect the growth of V. vulnificus, thereby emerging as potential drug targets for anti-virulence therapies with low selective pressure for developing resistance. Besides previously studied HlyU and IscR, NagC, MetJ, and Tet2 were identified to regulate the expression of major exotoxin genes, including rtxA, vvhA, and plpA, by directly binding to their regulatory regions. In particular, Tet2, which was initially identified as TF here, also affects the virulence of other pathogenic Vibrio species without affecting their growth, thereby appearing as a potential target to control the Vibrio infections. Altogether, this study systematically characterized the functions of TFs at a genome-wide scale and proposed CarR, NagC, MetJ, and Tet2 as novel targets to control the pathogenicity of V. vulnificus.

국문 초록 (Abstract)

병원성 세균들은 성공적인 감염을 위해 다양한 전사조절자(transcription factor, TF)들을 활용하여 숙주의 환경 신호를 인지하고 생존 및 독성 유전자들의 발현을 정교하게 조절한다. 본 연구에서는 생명을 위협하는 치명적인 병원성 세균인 비브리오패혈증균(Vibrio vulnificus)의 전체 전자조절자들의 기능을 포괄적으로 분석하였다. 이를 통해 생존 및 독성에 필수적인 전사조절자들을 비브리오패혈증균의 병원성 제어를 위한 잠재적 표적으로 발굴하고 이들의 조절 기전을 추가로 분석하였다. 구체적으로, 비브리오패혈증균의 총 285개 전사조절자 유전자에 특정 시그니처 태그를 삽입한 돌연변이 라이브러리를 구축하고 16가지 표현형 분석을 수행하였다. 그 결과, 비브리오패혈증균의 한 가지 이상의 표현형에 영향을 미치는 89개의 전사조절자들을 동정하였다. 이 중 59개 전사조절자들은 생장, 스트레스 저항성, 생물막 형성, 운동성을 포함한 in vitro 생존에 영향을 주었으며, 64개 전사조절자들은 독성에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 우선, 생존에 영향을 주는 59개의 전사조절자들 중 CarR은 비브리오패혈증균에 항생제 폴리믹신 B 저항성을 부여하는 주요 전사조절자로 밝혀졌다. CarR에 의한 폴리믹신 B에 대한 내성은 비브리오패혈증균의 치료를 어렵게 만드는 요인 중 하나이다. 따라서 CarR의 제어는 폴리믹신 B의 비브리오패혈증균에대한 항균 활성을 강화할 수 있을 것이다. CarR은 센서 카이네이즈 CarS와 함께 CarRS 이성분 조절 시스템(two-component system, TCS)을 구성하는 반응 조절자로 확인되었다. 전사체 분석 결과, CarR은 eptA, tolCV2, carRS 오페론의 발현을 강력하게 활성화하는 것으로 나타났다. 특히 eptA 오페론이 CarR에 의해 매개되는 폴리믹신 B 저항성에 중요한 역할을 담당하였다. 또한 CarS에 의한 CarR의 인산화가 이루어져야 하위 유전자의 조절이 가능하며, 이는 폴리믹신 B 저항성을 증가시키는 데에도 필수적이었다. 그럼에도 불구하고 CarR은 인산화 여부와 관계없이 eptA 및 carRS 오페론의 조절 부위에 직접 결합하는 것이 확인되었다. 주목할 만한 점은, CarRS TCS이 폴리믹신 B, 이가 양이온, 담즙산염, pH 변화 등 다양한 환경 스트레스에 반응하여 자체 활성 상태를 조절한다는 점이다. 또한 CarR은 이 중 폴리믹신 B 뿐 아니라 담즙산염 및 산성 pH에 대한 비브리오패혈증균의 저항성을 조절하는 것으로 나타났다. 종합적으로, CarRS TCS는 다양한 숙주 관련 신호에 반응하여 비브리오패혈증균의 숙주 내 생존을 향상시키고 성공적인 감염을 유도하는 데 기여할 수 있음을 시사한다. 한편, 비브리오패혈증균의 독성에 영향을 미치는 64개 전사조절자들 중 27개는 in vitro 용혈 활성 또는 세포 독성을 증가시키는 것으로 확인되었으며, 이들 중 8개 전사조절자들은 in vivo 브라인 쉬림프 또는 마우스 감염력을 증가시키는 것으로 확인되었다. 이 8개의 전사조절자들 중 HlyU, IscR, NagC, MetJ, Tet2는 비브리오패혈증균의 생장에는 영향을 주지 않는 것으로 나타나, 내성균 출현의 가능성이 낮은 항독성 치료제의 유망한 표적으로 제시되었다. 기존에 연구된 HlyU과 IscR외에도 NagC, MetJ, Tet2는 rtxA, vvhA, plpA 등 주요 외독소 유전자의 조절 부위에 직접 결합하여 발현을 조절하는 것으로 나타났다. 특히 본 연구에서 최초로 전사조절자로 규명된 Tet2는 다른 병원성 비브리오 종의 생장에도 영향을 미치지 않으면서 독성에 관여하는 것으로 확인되어, 비브리오 종들의 감염 제어를 위한 유망한 약물 표적으로 부각되었다. 종합적으로, 본 연구는 비브리오패혈증균의 전사조절자들의 기능을 유전체 수준에서 체계적으로 규명하였으며, CarR, NagC, MetJ, Tet2를 비브리오패혈증균의 병원성을 제어할 수 있는 새로운 표적으로 제안하였다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter I. Background 1
• I-1. Vibrio vulnificus 2
• I-1-1. Disease caused by V. vulnificus 3
• I-1-2. Survival and virulence factors of V. vulnificus 5
• I-1-3. Regulation of survival and virulence factors through transcription factors in V. vulnificus 16
• I-2. Objective of this study 20
• Chapter II. Genome-wide characterization of transcription factors in Vibrio vulnificus 21
• II-1. Introduction 22
• II-2. Materials and Methods 25
• II-2-1. Strains, plasmids, and culture conditions 25
• II-2-2. Identification of TFs 28
• II-2-3. Construction of a library of the V. vulnificus mutants carrying specific signature tags 31
• II-2-4. In vitro growth and stress resistance assays 35
• II-2-5. In vitro biofilm formation and motility assays 36
• II-2-6. In vitro virulence assay 37
• II-2-7. In vivo brine shrimp infectivity assay 38
• II-2-8. In vivo murine infectivity assay 39
• II-2-9. Transcriptome analysis 40
• II-2-10. Statistical analysis 43
• II-2-11. Data availability 43
• II-3. Results 44
• II-3-1. Genome-wide identification of TFs led to the construction of 285 mutants 44
• II-3-2. Phenotypic profiling of the 285 TF mutants identified 89 TFs essential for survival and virulence 46
• II-4. Discussion 79
• Chapter III. CarRS two-component system essential for the polymyxin B resistance of Vibrio vulnificus 91
• III-1. Introduction 92
• III-2. Materials and Methods 96
• III-2-1. Strains, plasmids, and culture conditions 96
• III-2-2. Generation and complementation of mutants 99
• III-2-3. Transcriptome analysis and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) 102
• III-2-4. Antimicrobial susceptibility test 103
• III-2-5. Construction of mutants producing CarRD55A and CarSH220A 103
• III-2-6. Protein purification and Western blot analysis 104
• III-2-7. Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) and DNase I protection assays. 105
• III-2-8. Construction of PcarRS-luxCDABE transcriptional fusion. 106
• III-2-9. Viability assay 107
• III-2-10. Statistical analysis 108
• III-2-11. Data availability 108
• III-3. Results 109
• III-3-1. The response regulator CarR contributes to the polymyxin B resistance of V. vulnificus 109
• III-3-2. Transcriptome analysis identified the CarR-regulated genes 112
• III-3-3. CarR develops the polymyxin B resistance through the activation of the eptA operon 116
• III-3-4. CarR phosphorylation is essential for the gene regulation and the polymyxin B resistance 120
• III-3-5. CarR directly binds to the regulatory regions of the eptA and carRS operons 127
• III-3-6. The CarRS TCS responds to multiple signals related to host environments 133
• III-3-7. CarR is associated with resistance to bile salts and acidic pH 136
• III-4. Discussion 139
• Chapter IV. NagC, MetJ, and Tet2 essential for the virulence of Vibrio vulnificus 144
• IV-1. Introduction 145
• IV-2. Materials and Methods 148
• IV-2-1. Strains, plasmids, and culture conditions 148
• IV-2-2. Murine lethality assay 150
• IV-2-3. RNA purification and quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) 150
• IV-2-4. Protein purification 154
• IV-2-5. DNase I protection assays 154
• IV-2-6. Generation of deletion mutants 156
• IV-2-7. Virulence assays 156
• IV-2-8. Statistical analysis 157
• IV-2-9. Data availability 157
• IV-3. Results 158
• IV-3-1. NagC, MetJ, and Tet2 contribute to the virulence of V. vulnificus 158
• IV-3-2. NagC, MetJ, and Tet2 develop virulence through the regulation of the major exotoxin genes 164
• IV-3-3. NagC, MetJ, and Tet2 directly bind to the regulatory regions of the exotoxin genes 166
• IV-3-4. Tet2 is essential for the virulence of other Vibrio species 169
• IV-4. Discussion 173
• Chapter V. Conclusion 178
• References 182
• 국문초록 194