Generation of recombinant vaccine strains exhibiting enhanced protective responses to H9N2 and H5N1 avian influenza viruses = H9N2 및 H5N1 조류인플루엔자 바이러스에 대한 방어능이 향상된 재조합 백신주의 제작

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

H9N2 and H5N1 avian influenza viruses (AIVs) are among the most significant subtypes impacting the poultry industry, posing significant economic and public health threats. The low pathogenic H9N2 subtype is endemic in poultry farms across many countries, leading to poor production performance and increased vulnerability to secondary infections, which result in substantial economic losses. Additionally, H9N2 serves as a key 'gene donor' in the emergence of novel influenza A virus through genetic reassortment, contributing to human infecting subtypes such as H5Nx and H7N9. On the other hand, H5N1 is a highly pathogenic virus that causes fatal infections in poultry worldwide, necessitating stringent national-level control measures due to its major economic impact. Both H9N2 and H5N1 not only cause enormous economic losses to poultry industry but also pose zoonotic risks. In particular, the globally circulating H5N1 clade 2.3.4.4b has recently shown increased infections in mammals and animal-to-human transmission, raising further concerns related to its zoonotic potential.
To control the spread of AIVs, various strategies—such as biosecurity, disinfection, stamping-out, and vaccination—have been actively employed. However, despite these comprehensive measures, it remains a challenge to prevent the continual introduction of the virus from wild birds or contaminated environments, as well as its subsequent spread among poultry. Many countries currently employed vaccination policy against H9N2 viruses and some also target H5N1 subtype. Although these vaccines offer partial protection, they fail to induce sterilizing immunity sufficient to completely prevent viral shedding. Moreover, their narrow antigenic coverage necessitates periodic updates to effectively match newly emerging viral variants.
To mitigate the economic burden on the poultry industry and reduce zoonotic risks posed by H9N2 and H5N1, my study focused on development of high-yield vaccine strains capable of eliciting strong and broad immune responses through genetic engineering and reassortment using reverse genetics technology, along with optimization of viral inactivation methods. First, instead of relying on traditional serial egg-passaging, genetically modified H9N2 vaccine strains were designed to enhance replication efficiency and immunogenicity. Second, through reverse genetics and optimized viral inactivation techniques were used to develop an intranasal inactivated vaccine targeting the globally circulating H5N1 clade 2.3.4.4b, aiming to elicit mucosal immune responses comparable to those induced by live vaccines. Third, a chimeric H5N2 vaccine strain was generated to provide simultaneous (concurrent) protection against both H5N1 and H9N2 viruses.
To develop an improved H9N2 vaccine strain with enhanced replication efficiency in embryonated chicken eggs and immunogenicity compared to existing vaccine strain, viral replication efficiency and antigenic structure were optimized using reverse genetics technology. Specifically, the PB2 gene was replaced with that of a previously developed low-pathogenic H9N2 virus (01310 strain); an 18-amino-acid deletion in the NA stalk which acquired through egg adaptation was restored; and the N-glycan at HA position 158 was removed. The resulting vaccine strain showed approximately a 10-fold increase in viral yield compared to the wild-type virus without requiring extensive egg passaging. In chickens, this strain induced an approximately 10-fold enhancement in heterologous NA-specific immune responses compared to wild-type-based vaccines. Interestingly, restoring the NA stalk length alone did not sufficiently boost NA immunogenicity, but additional removal of the HA N-glycan at position 158 markedly increased NA-specific responses. This enhancement contributed to improved cross-neutralization against both Y280 and North American lineage H9N2 viruses.
To address the threat posed by clade clade 2.3.4.4b H5N1, a high-yield vaccine strain for intranasal administration was developed using reverse genetics, incorporating the 01310-derived PB2 gene to enhance virus replication. The vaccine strain showed approximately a 10-fold higher yield than the conventional PR8 PB2-based vaccine. The vaccine strain was then inactivated with formaldehyde (F/A), β-propiolactone (BPL), or binary ethylenimine (BEI), and evaluated in mice following intranasal immunization. Among inactivation methods, BEI-inactivation elicited the strongest immune responses, including increased mucosal IgA levels and T-cell activation, offering superior cross-protective efficacy against antigenically distinct H5N1 clades and even heterosubtypic H1N1 viruses.
Finally, a dual protective 'H5N2' chimeric vaccine strain against H5N1 and H9N2 was developed using reverse genetics by combining the H5 gene from H5N1 with the N2 gene from H9N2. To enhance immunogenicity, the N-glycan in the HA2 stem region was removed, and the PR8-derived M2e was replaced with that of an avian-derived variant lacking N-glycans, unmasking critical epitopes. The optimized H5N2 strain showed > 10-fold higher yield in embryonated chicken eggs compared to the H5N1 vaccine strain. The vaccine strain was then inactivated using either F/A or BEI, and its immunogenicity was assessed in chickens. Notably, the combination of N-glycan removal and BEI inactivation significantly boosted both H5- and N2-specific antibody responses, providing robust cross-neutralizing immunity against both H5N1 and H9N2 subtypes.
In conclusion, this study addresses key limitations of existing vaccine strategies against H9N2 and H5N1 AIV subtypes by integrating reverse genetics-based antigen optimization with appropriate inactivation methods, thereby presenting a flexible vaccine development strategy applicable to various AIV subtypes. Notably, the marked improvement in vaccine productivity and the expansion of immune responses significantly enhanced both economic feasibility and field applicability. Furthermore, this study underscores the importance of NA-specific and mucosal immunity beyond conventional HA-focused approaches, highlighting the need for broader and more comprehensive protective strategies. Moreover, the proposed strategy offers a practical approach for rapidly responding to continuously evolving and co-circulating AIV variants and is expected to contribute to the prevention of zoonotic transmission and the long-term sustainability of the poultry industry.

국문 초록 (Abstract)

조류인플루엔자 바이러스 H9N2와 H5N1은 가금산업에서 가장 중요한 조류인플루엔자 아형으로, 가금 생산성 저하 및 폐사와 같은 심각한 경제적 피해를 유발하고 있다. H9N2 저병원성 조류인플루엔자는 전 세계적으로 가금에서 가장 널리 분포하는 아형으로, 그 자체로 질병 발생 피해를 유발할 뿐만 아니라, 다양한 조류인플루엔자 바이러스 간 유전자 재조합 과정에서 '유전자 공여자'로 작용하여 H5Nx, H7N9 등의 인수공통 신종 인플루엔자 A 바이러스 출현에 중요한 역할을 한다. 반면, H5N1 고병원성 조류인플루엔자는 가금에서 치명적인 폐사를 유발하며, 철새를 통한 지속적인 유입으로 전 세계적으로 반복적인 대유행을 야기하고 있어 국가 차원의 방역 관리가 필수적이다. 특히, H9N2와 H5N1(clade 2.3.4.4b) 아형에 의한 인체 감염 사례가 최근에 크게 증가하고 있어 그 공중보건학적 우려가 더욱 증대되고 있다.
차단 방역, 소독, 살처분, 백신 접종 등 다양한 전략이 가금류에서의 조류인플루엔자 확산을 막기 위해 시행되고 있지만, 철새 이동이나 오염된 환경을 통한 바이러스 유입과 그로 인한 가금 내 확산을 완전히 차단하는 데는 여전히 구조적인 한계가 있다. H9N2의 경우, 상재 국가에서는 가금 피해 예방을 위해 백신 접종이 널리 시행되고 있으며, H5Nx의 경우에는 중국, 이집트 등 일부 국가에서만 백신이 제한적으로 사용되고 있다. 현재의 상용 백신은 폐사 감소 및 생산성 향상에 기여하고 있으나, 바이러스 감염 자체를 완전히 차단하는 데는 한계가 있으며, 동일 아형 내 지속적인 변종 출현에 대응하여 주기적인 백신주 갱신이 요구되고 있다.
이에 본 연구에서는 현장에서 반복적으로 발생하는 H9N2 및 H5N1 아형 AIV의 효과적인 통제를 목표로, 유전공학 기반 기술을 활용하여 방어 효능이 향상된 차세대 백신주 및 면역 전략을 개발하고자 하였다.
첫째, 기존의 계대 배양 기반 백신 개발 방식 대신, 역유전학 기술과 유전자 조작 기법을 적용하여 고증식성과 고면역원성을 동시에 갖춘 H9N2 백신주를 개발하였다. 이를 위해 내부 유전자 중 PB2를 저병원성 AIV 01310주 유래 유전자로 대체하고, 계대 배양 과정에서 결실된 뉴라미니데이즈(NA) 줄기 부위의 18개 아미노산을 복원하였으며, 헤마글루티닌(HA) 단백질의 158번 위치에 존재하는 N-글리칸을 제거하여 복제 효율과 항원 구조를 최적화하였다. 개발된 재조합 H9N2 백신주는 SPF 닭 종란에서 기존 야생형 바이러스 대비 약 10배 이상의 바이러스 수율을 나타냈으며, 면역원성 평가 결과 이종항원에 대한 NA 특이적 면역반응이 약 10배 증가하였다. 특히, NA stalk의 복원만으로는 NA 항체 반응이 크게 증가하지 않았으나, HA N-글리칸의 추가 제거 시 NA에 대한 면역반응이 현저히 향상되었고, 이를 통해 Y280 및 북미 계통을 포함한 다양한 H9N2 바이러스에 대한 교차중화 효과가 확인되었다.
둘째, clade 2.3.4.4b H5N1 바이러스에 대해 생백신 수준의 점막 면역 유도가 가능한 고효율 사독 백신주를 개발하고자 하였다. 역유전학 기술을 활용하여 비강 투여에 적합한, 구조 안정성이 우수한 백신주를 설계하고, 01310 유래 PB2 유전자 도입을 통해 증식능을 향상시켰다. 이 백신주는 PR8 유래 PB2가 도입된 백신주 대비 약 10배 높은 항원 수율을 나타냈으며, 포름알데히드, 베타-프로피올락톤(BPL), 바이너리 에틸렌이민(BEI)을 각각 사용하여 불활화한 후 마우스에 비강 투여하여 면역반응을 평가하였다. 그 결과, BEI로 불활화한 백신에서 점막 IgA 생성 및 T세포 반응이 가장 활발하게 유도되었으며, 다른 strain의 H5N1뿐만 아니라 H1N1 아형에 대해서도 우수한 교차 방어 효과를 나타내었다.
셋째, H5N1과 H9N2 아형 모두에 대해 교차 방어능을 갖는 이중 항원 기반 키메라 백신주(H5N2)를 개발하였다. H5N1 유래 HA와 H9N2 유래 NA를 결합한 키메라 바이러스를 제작하고, HA2 줄기 부위의 N-당화 부위를 제거하였으며, PR8 유래 M2e 단백질을 조류 유래 비당화형으로 대체하여 항원 결정기의 노출을 최적화하였다. 해당 백신주는 발육란에서 기존 H5N1 백신주보다 약 10배 높은 항원 수율을 보였다. 이후, 백신주를 포름알데히드 또는 BEI로 불활화한 뒤 닭에 접종한 결과, 특히 N-글리칸 제거와 BEI 불활화의 병행 처리는 H5 및 N2 특이 항체 반응을 현저히 증가시켜 H5N1과 H9N2 아형 모두에 대해 강력한 교차중화 면역을 유도하였다.
결론적으로, 본 연구는 H9N2 및 H5N1 아형 AIV에 대한 기존 백신 전략의 한계를 극복하고자, 역유전학 기반의 유전자 최적화와 적절한 불활화 방법을 융합하여 다양한 AIV 아형에 적용 가능한 유연한 백신주 개발 전략을 제시하였다. 특히, 백신 생산성의 비약적 향상과 면역 방어 범위의 확장을 통해 경제성과 현장 적용성이 크게 향상되었으며, 기존 HA 중심의 면역 전략을 넘어 NA 특이적 면역과 점막 면역의 중요성을 규명함으로써 보다 광범위한 방어 전략의 필요성을 강조하였다. 나아가 본 전략은 지속적으로 변이하고 동시에 순환하는 조류인플루엔자 바이러스 변이체에 신속히 대응할 수 있는 실용적 접근법으로, 인수공통감염병의 사전 차단과 가금 산업의 지속 가능성 확보에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• Abstact ⅰ
• Contents ⅴ
• List of figures vii
• List of tables iⅹ
• List of supplementary data x
• Abbreviations xi
• General introduction 1
• Literature review 12
• 1. Influenza A virus 12
• 2. Epidemiology and zoonotic threats 21
• 3. Immunity 26
• 4. Vaccines and vaccination 31
• 5. Genetic engineering and vaccine development 37
• 6. Inactivation for vaccine production 43
• 7. Conclusion 46
• Chapter 1. Generation of a high-yield recombinant H9N2 vaccine strain with enhanced NA immunogenicity 49
• Abstract 50
• Introduction 51
• Materials and methods 53
• Results 58
• Disucussion 72
• Supplementary materials 77
• Chapter 2. Generation of an H5N1 vaccine strain with enhanced mucosal immunogenicity through combined antigen design and inactivation method optimization 79
• Abstract 80
• Introduction 81
• Materials and methods 84
• Results 98
• Disucussion 128
• Supplementary materials 137
• Chapter 3. Model H5N2 vaccine strain for dual protection against H5N1 and H9N2 avian influenza viruses 142
• Abstract 143
• Introduction 144
• Materials and methods 147
• Results 157
• Disucussion 170
• Supplementary materials 177
• General conclusion 179
• Reference 184
• 국문초록 203