Electrophysiological and Immunohistochemical Investigation of Auditory Dysfunction in Otof Knock-in Mice : Revealing Hidden Subclinical Haploinsufficiency of Otof = Otof 삽입 변이 마우스의 청각 기능 이상에 대한 전기생리학적 및 면역조직화학적 분석

국문 초록 (Abstract)

OTOF 유전자는 와우 내유모세포의 시냅스에서 신경전달물질 방출 및 소포 재활용에 필수적인 otoferlin 단백질을 암호화한다. OTOF의 변이는 선천성 청각신경병성 스펙트럼 장애(ANSD)를 유발하는 것으로 알려져 있다. 유전자 치료가 마우스 모델에서 청력 역치를 개선시켰으나, otoferlin의 기능은 여전히 불완전하고 시냅스 수 또한 유의미하게 개선되지는 않았다는 연구 결과가 있다. 이는 청력 역치의 개선에도 불구하고 숨은 청력 손실(hidden hearing loss, HHL) 이 여전히 지속되고 있음을 시사한다. 본 연구에서는 동아시아 인구에서 발견된 DFNB9의 기저 변이 (founder allele) 인 OTOF의 p.R1939Q에 해당하는 변이(p.R1934Q)가 있는 단일 이형접합 마우스(Otof+/p.R1934Q)가 숨은 청각 결손을 보이는지 여부를 연구하였다.
CRISPR/Cas9를 이용해 Otof 유전자에 p.R1934Q 변이를 도입한 마우스 모델을 만들어 청각학적, 조직학적 특성을 유전형에 따라 비교하였다. Otof+/p.R1934Q 마우스에서 청각뇌간반응(ABR) 역치는 정상 범위였으나, wave I과 II의 진폭이 감소하였으며, 이는 시냅스 전달의 결함 가능성을 시사한다. 조직학적 분석 결과, Otof+/p.R1934Q 마우스 내유모세포의 리본 시냅스 수가 감소한 것이 확인되었으며, 특히 와우의 첨부 및 중간 회전에서 이러한 경향이 두드러졌다. 그러나 내유모세포의 내유모세포 수의 손실은 관찰되지 않았고, 이는 청각 결손이 시냅스 결함에 기인함을 의미한다. 또한, Otof+/p.R1934Q 마우스에서 나선 신경절 뉴런(spiral ganglion neuron, SGN)의 밀도가 감소하였으며, Otofp.R1934Q/p.R1934Q 마우스의 경우 기저 회전에서 조기에 SGN 손실이 관찰되었다. 유전자 발현 분석에서 Otof mRNA의 발현 수준은 모든 유전자형에서 유사하였으나, Otof+/p.R1934Q 마우스에서 otoferlin 단백질 발현이 다소 감소하였으며, Otofp.R1934Q/p.R1934Q 마우스에서는 현저히 감소하였다. 이는 otoferlin 단백질 감소가 관찰되는 청각 표현형에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 사람을 대상으로 한 파일럿 연구에서 정상 청력을 가진 OTOF 변이 보인자들은 주파수 변별 및 간격 탐지에서 어려움을 겪었으며, 이는 마우스 모델의 연구 결과와 일치한다. 본 연구는 Otof 돌연변이 대립유전의 단일 이형접합 보인자가 haploinsufficiency로 인해 숨은 청력 손실을 나타낼 수 있음을 보여주었다. 이는 DFNB9 환자의 부모나 형제가 진단되지 않은 숨은 청력 손실을 가질 수 있음을 의미한다. 또한, 성공적인 OTOF 유전자 치료가 이러한 청각 결손을 완전히 해결하지 못할 수 있으므로, 일반 인구 및 DFNB9 가족의 OTOF 이형접합 보인자에서 나타나는 청각 표현형에 대한 추가 연구가 필요할 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The OTOF gene encodes otoferlin, essential for neurotransmitter release and vesicle recycling at cochlear inner hair cell (IHC) synapses. Variants in OTOF leads to prelingual auditory neuropathy spectrum disorder (ANSD). Gene therapy has improved hearing thresholds in mouse models, yet otoferlin remained suboptimal and synapse counts not significantly improved, suggesting persistent hidden hearing loss (HHL). This study explores whether single heterozygous mice (Otof+/p.R1934Q) carrying the DFNB9 founder allele in East Asians (p.R1939Q of OTOF) exhibit hidden audiological deficits. Using CRISPR/Cas9, we generated a mouse model with the p.R1934Q at the Otof locus. While auditory brainstem response thresholds were normal, Otof+/p.R1934Q mice showed reduced wave I and II amplitudes, indicating potential synaptic transmission defects. Histological analysis revealed fewer paired IHC ribbon synapses in Otof+/p.R1934Q mice compared to the wild-type controls, particularly in the apical and middle cochlear turns, without loss of IHCs or outer hair cells. This suggests that synaptic disruptions rather than hair cells loss contribute to the observed auditory deficits. Furthermore, it was followed by spiral ganglion neuron (SGN) density reduction in Otof+/p.R1934Q mice with earlier SGN loss in the basal turn of Otof p.R1934Q/p.R1934Q mice. Otof mRNA levels were similar across genotypes, but otoferlin protein levels were reduced in Otof+/p.R1934Q mice and notably lower Otofp.R1934Q/p.R1934Q mice, suggesting that reduced otoferlin level affects the observed audiological phenotype. Human pilot studies of normal hearing OTOF variant carriers revealed difficulties in frequency discrimination and gap detection, consistent with the mouse findings. This study demonstrates that single heterozygous carriers of the Otof mutant allele exhibit HHL due to haploinsufficiency. This implies that parents or siblings of DFNB9 patients may also have undiagnosed HHL. Additionally, successful OTOF gene therapy may not fully address these subclinical audiological deficits, highlighting the need for further research on the auditory phenotypes of single heterozygous carriers of OTOF in the general population and DFNB9 families.

목차 (Table of Contents)

• Introduction 1
• Materials and Methods 8
• Results and Discussion 18
• Conclusion 26
• Figures 28
• References 50
• Abstract in Korean 54