The effect of ZnO-Loaded PCL fibers on promoting bone healing in the elderly mouse through the modulation of NETosis = NETosis 조절을 통한 노화된 쥐의 뼈 손상 회복에 대한 효과

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Age-related delays in bone healing are largely driven by impaired regeneration and prolonged inflammation. NETosis, a neutrophil-mediated innate immune response, plays an important role in tissue repair under physiological conditions. However, in aging, excessive NET formation contributes to chronic inflammation and delayed healing. Zinc is an essential trace element that regulates immune function and inflammation, but its levels tend to decline with age. This study explores whether zinc oxide nanoparticle-infused polycaprolactone (ZnPCL) fibers, which gradually release zinc, can help modulate NETosis and immune responses, and improve bone healing in aged mice.
In aged mice, calvarial bone healing was significantly delayed compared to young mice, accompanied by persistent neutrophil presence and elevated levels of pro-inflammatory cytokines. Both in vivo and in vitro assays revealed increased NETosis in aged neutrophils. RNA-seq and GO analyses revealed decreased expression of zinc transporter genes and enhanced inflammatory signaling. Intracellular zinc levels in neutrophils were markedly lower in aged mice, and zinc deficiency was associated with enhanced NETosis. TPEN-induced zinc depletion in young neutrophils increased NETosis, while zinc supplementation with ZnCl or ZnO in aged mice restored zinc levels and reduced NET formation. Notably, ZnO entered neutrophils via endocytosis, demonstrating a pathway for intracellular zinc restoration.
ZnPCL fibers were shown to be biocompatible and effectively elevated intracellular zinc levels in aged neutrophils. They significantly reduced NETosis both in vitro and in vivo and also promoted macrophage recruitment and M2 polarization—key steps in resolving inflammation. As a result, ZnPCL treatment restored bone regeneration in aged mice, improving bone mineral density and new bone formation to levels comparable with young controls.
In summary, this study demonstrates that excessive NETosis and zinc deficiency contribute to impaired bone healing in aging. ZnPCL fibers offer a promising strategy to counteract these effects by regulating NETosis and inflammation, highlighting their therapeutic potential for enhancing bone repair in aged individuals.

국문 초록 (Abstract)

노화가 진행되면 뼈의 재생 속도가 느려지고 염증이 오래 지속되면서 골 치유가 지연된다. NETosis는 중성구가 매개하는 선천 면역 반응으로, 정상적인 조직 회복에는 도움이 되지만, 고령에서는 NETosis가 과도하게 증가해 만성 염증을 유발하고 뼈 회복을 방해한다. 아연은 면역 기능과 염증 조절에 중요한 역할을 하는 필수 미량 원소이며, 나이가 들수록 체내 아연 수치는 점차 감소한다. 본 연구에서는 아연을 서서히 방출하는 ZnPCL 섬유가 고령 생쥐에서 면역 반응을 조절하고 뼈 치유를 촉진할 수 있는지를 평가하였다.
고령 생쥐는 젊은 생쥐에 비해 두개골 결손의 회복이 느리고, 수술 후 7일이 지나도 중성구가 지속적으로 존재하며 염증성 사이토카인 수치가 높게 유지되었다. NETosis는 고령 생쥐에서 in vivo와 in vitro 모두에서 증가하였고, 전사체 분석과 유전자 발현 결과에서는 아연 수송 관련 유전자가 감소하고 염증 관련 유전자는 증가하는 양상을 보였다. 고령 생쥐의 중성구에서는 세포 내 아연 농도가 유의하게 감소하였고, 이러한 아연 결핍은 NETosis 증가와 관련이 있었다. TPEN을 이용해 아연을 제거하면 NETosis가 증가하였고, ZnCl₂나 ZnO를 처리하면 세포 내 아연 농도가 회복되면서 NET 형성이 억제되었다. 특히 ZnO는 엔도사이토시스를 통해 세포 내로 유입되어 아연 농도를 증가시키는 것으로 나타났다.
ZnPCL 섬유는 생체 적합성이 높으며, 고령 생쥐의 중성구에서 세포 내 아연 농도를 효과적으로 증가시켰다. 이로 인해 NETosis가 in vitro와 in vivo 모두에서 유의하게 감소하였고, 대식세포의 모집과 항염증성 M2형 전환도 촉진되어 염증 해소에 기여하였다. ZnPCL 처리군에서는 뼈 재생이 현저히 향상되었고, 골밀도와 신생골 형성 수준이 젊은 생쥐와 유사한 수준으로 회복되었다.
이 연구는 고령에서의 골 치유 지연이 과도한 NETosis와 아연 결핍에 의해 악화된다는 것을 보여준다. 또한 ZnPCL 섬유를 통한 국소 아연 공급이 NETosis와 염증 반응을 조절함으로써, 노화된 환경에서도 뼈 재생을 효과적으로 촉진할 수 있는 가능성을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract i
• Abbreviations iii
• List of Figures iv
• Table of Contents v
• I. Literature Review 1
• I. 1. Bone healing processes 1
• I. 2. Inflammation and bone healing 6
• I. 3. The effect of aging on bone healing 8
• I. 4. NETosis 12
• I. 5. Zinc and zinc-containing biomaterials for bone healing 17
• II. Introduction 21
• III. Experimental Techniques 23
• III. 1. Animal experiments 23
• III. 2. Electrospinning and Characterization of PCL and ZnPCL Nanofibers 23
• III. 3. MicroCT 24
• III. 4. H&E and immunofluorescence staining 25
• III. 5. Total RNA sequencing 26
• III. 6. RT-qPCR 27
• III. 7. Isolation of mouse neutrophils 27
• III. 8. In vitro NETosis assay 28
• III. 9. Measurement of intracellular free zinc ion level 28
• III. 10. Western blot 28
• III. 11. Statistical analysis 29
• IV. Results 30
• IV. 1. NETosis Is Elevated in Aged Mice Bone Defects In Vivo and In Vitro. 30
• IV. 2. Gene Expression and GO Analysis Suggest a Link Between Zinc, Inflammation, and Delayed Bone Formation in Aged Mice. 32
• IV. 3. Zinc Concentration Regulates the NET Formation. 33
• IV. 4. Physicochemical Characterization of ZnPCL Composite Nanofibers. 36
• IV. 5. ZnPCL Attenuates Excessive NET formation in Aged Mice In Vitro and In Vivo. 37
• IV. 6. ZnPCL Modulates Macrophage Recruitment and M2 Polarization in Bone Defects of Aged Mice. 39
• IV. 7. ZnPCL facilitated delayed bone healing in aged mice in vivo. 41
• V. Discussion 62
• VI. References 67