Development of vaccine adjuvants and mechanistic insights for combating Salmonella infection in chickens = 닭에서의 살모넬라 감염 대응을 위한 백신 보조제 개발과 면역 작용 기전 규명

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Salmonella infection poses a significant threat to poultry health and global food safety, causing substantial economic losses and zoonotic transmission through contaminated animal products. In chickens, effective control of Salmonella requires not only the development of protective vaccination strategies but also a deeper understanding of the innate immune mechanisms that govern host-pathogen interactions. While inactivated vaccines are widely used due to their safety, they often fail to elicit sufficiently robust immune responses, highlighting the need for adjuvant strategies to improve vaccine efficacy. Concurrently, macrophages act as primary cellular targets and reservoirs for intracellular Salmonella survival, yet the cellular and molecular mechanisms of macrophage-mediated defense in avian species remain poorly understood.
Part I of this dissertation focuses on the development of chicken-derived probiotics as natural adjuvants to enhance the immune efficacy of an inactivated Salmonella Typhimurium vaccine. Four probiotic strains, isolated from the intestinal contents of healthy chickens, were first evaluated in vitro using a chicken macrophage cell line. Among them, Lactobacillus salivarius (p-48) showed the strongest adjuvant potential by enhancing macrophage surface marker expression and cytokine production. In vivo experiments further demonstrated that co-administration of probiotics with the inactivated vaccine significantly reduced both systemic and intestinal Salmonella colonization compared to vaccination alone. No major differences in efficacy were observed between in ovo and oral probiotic delivery. Consistent with the in vitro findings, L. salivarius (p-48) showed the most pronounced adjuvant effect in vivo, outperforming L. crispatus (p-1) and L. reuteri (p-32). Functional antibody assays confirmed that p-48 enhanced antigen-specific IgY responses as well as bactericidal and opsonophagocytic activity, resulting in improved protective immunity.
Part II investigates the role of Toll-like receptor (TLR) signaling in chicken macrophage responses to Salmonella Typhimurium infection. Using wild-type (WT) and gene-edited TLR2⁻/⁻, TLR3⁻/⁻, and TLR4⁻/⁻ HD11 macrophage cell lines, comparative analyses were conducted under both phagocytosis and opsonophagocytosis conditions. The results demonstrated that TLR4 is essential for bacterial uptake and intracellular clearance during phagocytosis, whereas both TLR2 and TLR4 contribute to effective bacterial elimination during opsonophagocytosis. TLR4-deficient macrophages exhibited impaired activation, as indicated by reduced MRC1 downregulation, diminished ROS production, and limited SSC elevation. Transcriptomic analyses revealed divergent immune strategies between WT and TLR4⁻/⁻ macrophages, including increased expression of genes related to phagosomal maturation and humoral immune responses in the absence of TLR4 during opsonophagocytosis. Additionally, metabolic profiling uncovered enhanced compensatory glycolysis and distinct patterns of amino acid and fatty acid metabolism in TLR4⁻/⁻ macrophage, suggesting that TLR4 deficiency induces metabolic reprogramming in response to intracellular Salmonella.
Collectively, this dissertation highlights two complementary strategies for improving host defense against Salmonella in chickens: (1) the application of immune-enhancing probiotics as effective adjuvants to enhance inactivated vaccine efficacy, and (2) mechanistic insights into how TLR signaling, particularly TLR4, regulates macrophage activation, transcriptional responses, and metabolic adaptation during two distinct Salmonella uptake pathway. These findings provide a scientific basis for the development of integrated immunomodulatory and vaccine-based interventions to control Salmonella infection in poultry.

Keywords: Avian immunology, Salmonella, Vaccine adjuvant, Macrophage, TLR knock out, Immunometabolsim

Student number: 2021-30408

국문 초록 (Abstract)

Salmonella는 전 세계적으로 공중보건과 가금류 생산에 중대한 위협을 가하는 주요 식인성 인수공통 병원체이다. 특히 닭고기와 계란과 같은 가금류 및 가금류 유래 제품은 사람에게 Salmonella가 전파되는 가장 흔한 원인 중 하나로 알려져 있다. 따라서 가금류에서의 Salmonella 감염 을 줄이는 것은 동물 건강과 식품 안전성을 동시에 향상시키기 위한 핵심 과제로 간주된다. 이러한 상황에서 백신 접종은 가금류에서 Salmonella 감염을 통제하는 가장 효과적인 전략 중 하나로 인정되고 있으나, 안전성으로 인해 널리 사용되는 불활화 백신은 세포성 면역 유도가 상대적으로 약하다는 한계가 있으며, 이에 따라 보호 효능을 극대화하기 위한 보완 전략의 개발이 절실하다.
이러한 맥락에서 최근 프로바이오틱스는 항생제 대체제로서뿐만 아니라 백신의 면역보조제(adjuvant)로서의 가능성에 주목받고 있다. 실제로 여러 연구를 통해 프로바이오틱스가 가금류의 성장 촉진과 면역 조절에 긍정적인 영향을 미친다는 결과가 보고되었으나, 백신과 병용 시 유도되는 면역 반응을 기능적, 기전적 측면에서 향상시킬 수 있는지에 대한 연구는 아직 미흡하다. 특히, 실험 간 일관되지 않은 결과는 백신 병용 시 최적의 균주, 용량, 투여 방법 등을 체계적으로 규명할 필요성을 더욱 부각시키고 있다.
한편, 병원체 감염 초기 단계에서 대식세포는 선천면역의 중심적인 역할을 수행하는 주요 면역세포로, Salmonella가 장 상피를 통과한 직후 빠르게 포식되어 숙주 내에 침투한다. 이 과정에서 병원체는 SPI-2 유전자 등의 발현을 통해 대식세포의 면역 신호와 대사 경로를 교란함으로써 생존을 시도하며, 반대로 숙주의 대식세포는 TLR(Toll-like receptor)과 같은 패턴 인식 수용체(PRRs)를 통해 병원체를 감지하고 이에 대한 방어 반응을 유도한다. 이 중에서도 TLR4는 포유류에서 Salmonella 인식 및 제거에 핵심적인 역할을 하는 것으로 보고되어 왔으나, 조류 대식세포에서 TLR의 역할, 특히 세포 내 살균 및 대사 재프로그래밍에 관련된 기능은 여전히 명확히 밝혀지지 않았다.
본 학위논문의 제1부는 이러한 문제의식에 기반하여, 불활화 Salmonella Typhimurium 백신의 효능을 향상시키기 위한 천연 면역보조제로서 닭 유래 프로바이오틱스의 개발 및 최적화에 중점을 두었다. 연구의 주요 목표는 (i) 면역학적으로 활성이 우수한 프로바이오틱스 균주의 선별, (ii) 최적 투여 농도 및 경로의 규명, 그리고 (iii) 항원 특이 항체 반응 및 기능성 살균 활성을 통한 백신 증강 효과 평가였다. 이를 위해 본 연구는 in vitro 및 in vivo 실험을 병행하여 면역보조 효과를 검증하였으며, 특히 serum bactericidal assay(SBA) 및 opsonophagocytic killing assay(OPKA)를 포함한 기능성 항체 분석법을 적용하여 백신 증강 효과를 정량적으로 평가하였다.
그 결과, 닭에서 분리한 Lactobacillus salivarius (p-48)는 불활화 Salmonella 백신의 효능을 유의하게 증강시키는 효과적인 면역보조제로 확인되었다. 해당 균주의 면역자극 효과는 항원 특이적 IgY의 증가뿐만 아니라, SBA 및 OPKA 결과를 통해 확인된 살균 및 옵소닌화 기능을 유도하는 기능성 항체의 생성 증가로 입증되었다. 특히 이러한 면역 증강 효과는 투여 경로보다는 균주의 특이성에 따라 결정되는 경향이 강했으며, 이를 통해 기능성 항체 분석법이 백신 효능 평가에 있어 유용한 지표임이 강조되었다. 종합적으로, 본 연구는 항생제 의존도를 낮추면서도 백신 효과를 증진시킬 수 있는 실용적이고 안전한 전략으로서 프로바이오틱스 기반 면역보조제의 가능성을 제시하였다.
제2부에서는 Salmonella Typhimurium 감염에 대한 닭 대식세포의 반응에서 TLR 신호전달의 역할을 규명하고자 하였다. 이를 위해 wild-type뿐만 아니라 TLR2⁻/⁻, TLR3⁻/⁻, TLR4⁻/⁻ 유전자 결실 닭 대식세포주를 활용하여, phagocytosis와 opsonophagocytosis라는 두 가지 주요 병원체 섭취 방식 하에서 병원체의 섭취 및 제거 능력, 면역 활성화 상태, 전사체 및 대사체 변화를 포괄적으로 분석하였다. 특히, 면역세포 표현형 분석과 전사체–대사체 통합 분석을 통해 TLR 결핍이 유도하는 대식세포의 기능 변화와 대사 적응 현상을 규명하고자 하였다.
분석 결과, TLR4 신호전달은 대식세포의 Salmonella 감염 대응 과정에서 면역 활성화 및 식세포 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 하며, 병원체 섭취 방식에 따라 서로 다른 보상적 면역 및 대사 경로를 유도함이 확인되었다. 특히 TLR4 결핍 대식세포는 해당작용(glycolysis) 활성 증가 및 아미노산·지방산 대사의 재구성을 보였으며, 이는 병원체 제거에 필요한 에너지 공급 및 면역 반응 조절을 위한 대사 재프로그래밍 현상으로 해석된다.
종합적으로, 본 연구는 미생물 유래 면역보조제 개발과 선천면역 조절 간의 연계를 보여주는 통합적 개념 틀을 제시하였으며, 생리학적으로 타당한 병원체 섭취 조건 하에서 기능성 항체 분석과 전사체–대사체 통합 분석을 연계함으로써 맞춤형 백신–보조제 전략의 기전적 근거를 마련하였다. 이러한 연구 결과는 가금류의 점막 및 전신 면역 방어를 강화함과 동시에, 면역 반응의 정밀한 조절이 요구되는 축산 질병 대응 전반에 걸쳐 폭넓은 응용 가능성을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract I
• Contents IV
• List of Figures VII
• List of Tables X
• List of Abbreviations XI
• Review of Literature 3
• 1. Antibiotics in chicken 3
• 1-1. Challenges and limitations of antibiotics 3
• 1-2. Immunomodulants as alternatives to antibiotics 7
• 1-2-1. Probiotics 7
• 1-2-2. Polysaccharides 10
• 1-2-3. Toll-like receptor ligands 12
• 1-2-4. Antimicrobial peptides 23
• 1-2-5. Egg yolk IgY antibodies 25
• 2. Salmonella spp. 32
• 2-1. Nomenclature and classification 32
• 2-2. Pathogenesis and immune responses 37
• 2-2-1. Salmonella pathogenicity island-1 38
• 2-2-2. Salmonella pathogenicity island-2 39
• 2-2-3. Salmonella pathogenicity island-3, -4 and -5 41
• 2-2-4. Macrophage metabolism and intracellular survival mechanisms of Salmonella 42
• 2-2-5. Virulence factors and immune response in chickens 45
• 2-3. Vaccination strategies in the poultry industry 48
• General Introduction 55
• Part I 58
• I. Introduction 59
• II. Materials and Method 63
• III. Results 75
• 1. Probiotics exert immune-modulating effects in chicken macrophages 75
• 2. The vaccine and probiotic doses were optimized to maximize protective efficacy against Salmonella infection in chickens 87
• 3. Probiotics require co-administration with a vaccine for effective suppression of Salmonella infection 97
• 4. Route of probiotic administration does not affect vaccine efficacy or functional antibody responses 101
• 5. P-48 exhibits the strongest adjuvant effect, enhancing vaccine efficacy through functional antibody responses 107
• IⅤ. Discussion 111
• Part II 121
• I. Introduction 122
• II. Materials and Method 125
• III. Results 136
• 1. TLR deficiency in macrophages alters the uptake and intracellular clearance of Salmonella 136
• 2. TLR deficiency in macrophages infected with Salmonella induces distinct responses under phagocytosis and opsonophagocytosis conditions 141
• 3. Distinct gene expression profiles between WT and TLR4⁻/⁻ macrophages during phagocytosis reflect divergent immune strategies 149
• 4. TLR4 deficiency promotes alternative innate immune programs during opsonophagocytosis 156
• 5. TLR4-deficient macrophages exhibit distinct metabolic adaptation to Salmonella infection 163
• IⅤ. Discussion 168
• V. Conclusion 178
• VI. Literature Cited 180
• VII. Summary in Korean 194