Characterization of Tumor-Infiltrating Lymphocytes and Their Spatial Distribution in Triple-Negative Breast Cancer = 삼중음성유방암에서 종양침윤림프구 및 그 공간적 분포의 특성 분석

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background: The tumor immune microenvironment, particularly tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), plays a critical role in disease progression and treatment response in triple-negative breast cancers (TNBCs). This study was aimed to characterize the composition of TILs and investigate their clinicopathological and prognostic significance with a special focus on the spatial distribution of TILs in TNBCs.
Methods: We analyzed TNBC samples through PanCancer Immune Profiling using NanoString nCounter assays to identify immune-related genes that are expressed differentially in relation to TIL levels and evaluated protein expression of selected markers through immunohistochemical staining on tissue microarrays. For a comprehensive assessment of the expression of cytotoxic T lymphocyte (CTL) and natural killer (NK) cell markers, a CTL-NK score was devised based on CD8+, CD56+, CD57+, granulysin (GNLY)+, and granzyme B (GZMB)+ TIL levels.
Results: Gene expression analysis revealed significant upregulation of CTL and NK cell-associated genes including GNLY, KLRC2, and GZMB in TIL-high TNBCs. Immunohistochemical validation confirmed that TNBCs with higher TILs had a greater amount of CD56+, CD57+, GNLY+, and GZMB+ TILs not only in absolute number but also in proportion relative to CD4+ or CD8+ TILs. High TIL and its subset (CD4+, CD8+, CD56+, CD57+, GNLY+, and GZMB+ TIL) infiltration correlated with favorable clinicopathological features of tumor. In survival analysis, high CTL-NK score was found to be an independent prognostic factor for better disease-free survival (DFS) of the patients. Furthermore, uniformly high TIL infiltration was linked to better DFS, whereas cases with heterogeneous TIL infiltration showed no difference in survival compared to those with uniformly low TIL infiltration.
Conclusion: Our study showed that CTL and NK cell-associated gene expression and protein levels differ significantly according to TIL levels and that CTL-NK score and distribution of TILs within tumors have a prognostic value. These findings emphasize the importance of CTLs and NK cells as well as the spatial uniformity of TIL infiltration in clinical outcome of TNBC patients, providing valuable insights for refining prognostic assessments and guiding immunotherapeutic strategies.

국문 초록 (Abstract)

서론: 삼중음성유방암에서 종양 면역미세환경, 특히 종양침윤림프구는 질환의 진행 및 치료 반응에 중요한 역할을 한다. 본 연구는 삼중음성유방암에서 종양침윤림프구의 구성을 규명하고, 종양침윤 림프구의 공간적 분포에 중점을 두어 이들의 임상병리학적 및 예후적 의의를 평가하고자 하였다.
방법: 삼중음성유방암의 조직 샘플을 대상으로 NanoString nCounter를 이용한 PanCancer Immune Profiling을 시행하여 종양침윤림프구의 침윤 정도에 따른 면역 관련 유전자들의 발현의 차이를 분석하였다. 그 후, 발현에 차이를 보인 유전자를 선택하여 조직 마이크로어레이에서 면역조직화학염색을 통해 해당 단백질 산물의 발현을 평가하였다. 세포독성 T 림프구와 자연살해세포 표지자의 발현을 종합적으로 평가하기 위해 CD8, CD56, CD57, granlysin (GNLY), 그리고 granzyme B (GZMB) 양성 종양침윤림프구의 침윤 정도에 기반하여 CTL-NK 점수를 고안하였다.
결과: 유전자 발현 분석 결과, 종양침윤림프구의 침윤 정도가 많은 삼중음성유방암에서 세포독성 T 림프구 및 자연살해세포와 연관된 유전자인 GNLY, KLRC2, 그리고 GZMB의 발현이 유의하게 높았다. 면역조직화학염색으로 검증하였을 때, 종양침윤림프구가 많은 삼중음성유방암에서 CD56, CD57, GNLY, 그리고 GZMB 양성 림프구가 절대적인 수뿐만 아니라 CD4 또는 CD8 양성 림프구 대비 상대적인 비율 역시 유의하게 높았다. 전체 종양침윤림프구 및 그 아형들(CD4, CD8, CD56, CD57, GNLY, 그리고 GZMB 양성 종양침윤림프구)의 높은 침윤 정도는 종양의 양호한 임상병리학적 특징과 유의한 상관관계를 보였다. 생존 분석에서는 높은 CTL-NK 점수가 무병생존율을 향상시키는 독립적인 예후 인자로 확인되었다. 또한 종양침윤림프구의 침윤이 종양 내에서 균일하게 높은 경우 무병생존율이 더 양호하였으며, 침윤이 이질적인 경우에는 균일하게 낮은 경우와 비교하여 생존율 차이가 유의하지 않았다.
결론: 본 연구를 통해 종양침윤림프구의 침윤 정도에 따라 세포독성 T 림프구 및 자연살해세포 관련 유전자와 단백질의 발현이 유의하게 차이를 보이며, CTL-NK 점수 및 종양 내 종양침윤림프구의 공간적 분포가 삼중음성유방암 환자의 예후와 밀접한 관련이 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 삼중음성유방암 환자의 임상적 예후 예측 및 면역치료 전략 수립에 있어 세포독성 T 림프구와 자연살해세포의 침윤 정도 및 종양침윤림프구 침윤의 공간적 균일성이 중요함을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. Introduction 1
• Chapter 2. Methods 3
• Chapter 3. Results 9
• Chapter 4. Discussion 29
• Chapter 5. Conclusion 34
• Declarations 49
• Bibliography 50
• Abstract in Korean 55