Cas9-expressing cattle resources and organoid platforms: A resource-based approach to genome engineering = Cas9 발현 소 유래 자원과 오가노이드 플랫폼 기반 유전자 공학적 접근

국문 초록 (Abstract)

소 유전자 공학은 장기간의 임신 기간, 제한된 수정란 수, 그리고 높은 유지 비용과 같은 고유한 한계에 직면해 있다. 이러한 제약을 극복하기 위해, 최적화된 트랜스포존 시스템, 생식세포를 통해 유전자가 전달되는 Cas9 발현 형질전환 소, 배아줄기세포 유사 세포(ESC-like cells), 그리고 조직 유래 오가노이드 모델을 결합한 통합 플랫폼이 구축되었다. 세 가지 비바이러스성 트랜스포존 시스템(PiggyBac, Sleeping Beauty, Tol2)을 체계적으로 평가한 결과, PiggyBac(PB)은 소 체세포에서 98.4%의 형질전환 효율과 63.9%의 안정적인 유전자 통합 효율을 보여 우수한 성능을 나타냈으며, Sleeping Beauty(SB)와 Tol2는 배아 내에서 더 높은 GFP 발현을 보였다. 그러나 배 발달 능력을 종합적으로 고려했을 때, PB 시스템이 체세포와 수정란 모두에서 가장 최적의 유전자 도입 수단으로 평가되었다.
이에 따라 PB 시스템은 생체 내 적용을 위해 선택되었으며, PB 기반 올인원 벡터를 이용한 세포질 미세주입을 통해 Cas9 발현 형질전환 소가 성공적으로 생산되었다. 형질전환체의 통합 및 발현은 PCR, RT-PCR, 웨스턴블롯(WB), 형광 기반 분석(FBA)을 통해 확인되었고, IVF 및 자연교배를 통해 생산된 자손 모두에서 생식세포를 통한 유전 형질 전달과 PRNP 유전자 좌위의 성공적인 편집이 검증되었다.
이러한 Cas9 발현 자원의 활용도를 확장하기 위해 체세포 및 생식세포 기반 편집 플랫폼이 추가로 평가되었다. Cas9 발현 섬유아세포를 이용한 체세포 유전자 편집은 높은 돌연변이 유도 효율과 함께 체외에서의 발달 능력을 유지했으며, 이는 체세포핵이식(SCNT) 후 형성된 포배 발달을 통해 확인되었다. 또한 Cas9 발현 정자는 유전자 제거(knockout)와 삽입(knock-in) 모두에 활용 가능하였고, 소혈청알부민(BSA) 좌위에 대해 최대 54.2%의 표적 삽입 (knock-in) 효율을 달성하였다.
이러한 편집 결과를 바탕으로, 편집된 배반포로부터 배아줄기세포 유사 세포(ESC-like cells) 및 융모막세포(trophoblast cell) 계통의 유래 및 특성 분석이 수행되었다. 편집된 포배로부터 유래된 ESC-like 세포는 안정적인 형질전환체 발현과 함께 SOX2 등의 다능성 마커 및 Cas9 단백질을 여러 계대에 걸쳐 유지하며, 후속 기능 분석 및 재생의학적 응용 가능성을 입증하였다. 또한, 수정란에서 유래된 융모막세포는 정의된 조건하에서 안정적으로 배양되어, 태반 발달 및 유전자 기능 연구를 위한 체외 모델로 확립되었다.
플랫폼의 적용 범위를 조직 유래 모델까지 확장하기 위해 오가노이드 기반 유전자 편집도 수행되었다. 자궁내막 오가노이드(endometrial organoids)에서 효과적인 체외 유전자 편집이 가능하였으며, PRNP 및 BLG 유전자에 특이적인 sgRNA를 발현하는 렌티바이러스를 이용한 편집에서 각각 73% 및 59%의 indel 효율을 기록함으로써, 3차원 상피 환경에서의 CRISPR 기반 기능 연구 가능성을 입증하였다.
결론적으로, 본 연구는 트랜스포존 시스템 최적화, 생식전달형 Cas9 발현 소 자원, 배아줄기세포 유사 세포, 조직 유래 오가노이드를 결합한 통합형 유전자 공학 플랫폼을 제시하였다. 이 모듈형 시스템은 세포 유형에 따라 유연하게 적용 가능하며, 확장성과 유전성을 갖춘 소 유전자 연구, 질병 모델링, 생식생명공학의 발전을 위한 강력한 도구로 활용될 수 있을 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Genome engineering in cattle faces inherent challenges such as prolonged gestation, limited embryo yield, and high maintenance costs. To address these constraints, a comprehensive platform has been established combining optimized transposon systems, germline-transmissible Cas9-expressing cattle, embryonic stem-like (ESC-like) cells, and tissue-derived organoid models. Three non-viral transposon systems—PiggyBac (PB), Sleeping Beauty (SB), and Tol2—were systematically evaluated. PiggyBac (PB) exhibited superior transfection (98.4%) and stable integration (63.9%) efficiencies in bovine somatic cells, whereas Sleeping Beauty (SB) and Tol2 showed higher GFP expression in embryos. However, when considering overall embryonic developmental competence, PB was determined to be the most optimal system across both somatic cells and embryos.
Based on these findings, the PB system was selected for in vivo application, and Cas9-expressing cattle were generated through cytoplasmic microinjection of PiggyBac-based (PB-based) all-in-one vectors. Transgene integration and expression were verified by genomic polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription PCR (RT-PCR), Western blotting (WB), and fluorescence-based analyses (FBA). Germline transmission was confirmed in both IVF-derived and naturally bred offspring, with successful editing of the PRNP locus.
To further expand the applicability of these Cas9-expressing resources, both somatic and germline platforms were subsequently evaluated. Somatic cell-based gene editing using Cas9-expressing fibroblasts demonstrated high mutation efficiencies and preserved developmental competence, as evidenced by blastocyst formation following somatic cell nuclear transfer (SCNT). Cas9-expressing sperm enabled both knockout and knock-in editing, achieving targeted knock-in at the bovine serum albumin (BSA) locus with up to 54.2% efficiency.
Building upon these successful editing outcomes, downstream derivation and characterization of stem and trophoblast cell lineages were performed. Importantly, embryonic stem-like cells (ESC-like cells) were successfully derived from edited blastocysts. These ESC-like cells maintained stable transgene expression, pluripotency marker SOX2, and Cas9 protein across multiple passages, confirming their utility for downstream functional studies and regenerative applications. Additionally, trophoblast cell cultures were established from genome-edited embryos and maintained under defined conditions, providing a tractable in vitro system for studying placental development and gene function.
To extend this platform to tissue-derived models, gene editing capabilities were also assessed in organoid systems. Bovine endometrial organoids (EOs) supported efficient ex vivo gene editing. Lentiviral vectors encoding single guide RNAs (sgRNAs) targeting PRNP and BLG achieved indel frequencies of 73% and 59%, respectively, validating CRISPR-mediated functional studies in a 3D epithelial context.
Altogether, a comprehensive platform has been established combining optimized transposon systems, germline-transmissible Cas9-expressing cattle, embryonic stem-like (ESC-like) cells, and tissue-derived organoid models. This modular genome engineering system offers scalable, inheritable, and cell-type adaptable tools to advance bovine genetic studies, disease modeling, and reproductive biotechnology.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT 3
• TABLE OF CONTENTS 7
• LIST OF TABLES 10
• LIST OF FIGURES 12
• LIST OF ABBREVIATIONS 17
• PUBLICATION LISTS 20
• PART I. LITERATURE REVIEW 28
• 1. Genome engineering technologies in livestock 29
• 2. Transgenic livestock production 43
• 3. Application of genome engineered livestock 56
• 4. Organoid ex-vivo model and genome editing in livestock 70
• PART II. GENERAL METHODOLOGY 78
• 1. Reagents 79
• 2. Primary cell culture 79
• 3. Primary organoid culture 80
• 4. In vitro maturation 81
• 5. In vitro fertilization and in vitro culture of embryo 82
• PART III. Cas9-expressing cattle resources and organoid platforms 84
• Chapter Ⅰ. Optimization of transposon systems for bovine gene engineering 85
• 1. Introduction 85
• 2. Materials and methods 87
• 3. Results 93
• 4. Discussion 108
• Chapter II. Production and germline transmission of Cas9-expressing cattle using a PiggyBac All-in-One system 112
• 1. Introduction 112
• 2. Materials and methods 115
• 3. Results 121
• 4. Discussion 153
• Chapter III. Applications of Cas9 resources: Somatic, germline, and stem cell-derived platforms 158
• 1. Introduction 158
• 2. Material and methods 162
• 3. Results 177
• 4. Discussion 219
• REFERENCES 227
• 국문 초록 250