기혼합형 calcium silicate cement의 pH 변화에 따른 물리적 및 생물학적 특성 연구 = Study on the Physical and Biological Characteristics of Premixed Calcium Silicate Cements According to pH Changes

국문 초록 (Abstract)

1. 연구목적
본 연구의 목적은 최근 개발된 premixed putty-type calcium silicate
cement(CSC)인 One-Fil PT(OFPT)와 Well-Root PT(WRPT), 그리고 실험실 제작 powder-type CSC(pCSC)의 경화 시간에 따른 세포독성과 다양한 pH 환경(pH 4.4, 5.4, 6.4, 7.4)에서 무게의 변화를 관찰하는 것이다. 이는 치근단 역충전, 치근 천공 치료 등 다양한 근관
치료에서 CSC의 임상 적용을 위한 과학적 근거를 제공할 것이다.

2. 재료 및 방법
실험실에서 pCSC는 제조한 후 분말과 멸균 증류수를 3:1의 비율로 혼합하고, OFPT와 WRPT를 제조사의 지시에 따라 사용하였다. 금속 몰드를 이용하여 디스크 형태로 형성 후, 24시간 전에 증류수에 침전시킨 석고 위에서 37°C, 95% 습도 환경에서 12, 24, 48시간 경화한 후, ISO 10993-12에 준하여 용출을 준비하였다. 초기
경화시간과 최종 경화시간은 각각 ISO 6876:2012과 ISO 9917- 1:2007에 따라 측정했다. 초기 경화시간 측정을 위하여 무게 100 g, 직경 2 mm의 Gillmore 팁을 사용하였고, 최종경화시간 측정에는 무게 400 g, 직경 1 mm 팁을 사용하였다. 측정시간 동안 몰드는 습도 95%, 온도 37°C의 인큐베이터에 보관하였다. 용출은 시료 디스크 1 g 당 5 mL 세포배양 배지에서 3일 동안 37°C에서 실시였다. 용출 완료 후, 배지로 연속 희석하여 100, 75, 50, 25, 10%의 용출 희석액을
조제하였다. 세포독성 측정을 위해 NIH 3T3를 10% FBS와 항생제가 포함된 Dolbecco’s Modified Eagle’s Media배지로 희석하고 각 well에 접종하였다. 접종 후 37°C, 5% CO2 조건하에서 24시간 동안 배양하고 배지를 제거 후, 용출액과 용출 희석액을 각 well에 첨가하고 24시간 배양하였다. 음성대조군은 용출액이 포함되지 않은 배지를 사용하였다. 세포독성 평가를 위하여 EZ-Cytox Cell Viability Assay Kit로 미토콘드리아 dehydrogenase 활성을 측정하였다. 각 well의 배지를 10% EZ-Cytox 용액이 포함된 신선 배지로 교환하고 37°C에서 4시간 반응시킨 후 plate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 다양한 산성환경에서 무게 변화와 표면관찰을 위해 pCSC 분말과 멸균 증류수를 3:1의 비율로 혼합하고, OFPT와 WRPT를
제조사의 지시에 따라 사용하였다. 금속 몰드를 이용하여 디스크 형태로 형성 후, 초기 경화 후 정밀 저울을 사용하여 각 시편의 초기 무게를
기록하였다. 세 종류의 CSC 시편을 보관 용액과 기간에 따라 무작위로 배정하였다. 보관 용액으로는 HCl로 pH 4.4, 5.4, 6.4, 7.4로 적정된 phosphate buffered saline을 사용하였으며, 시편은 37°C에서 1주, 2주, 3주, 4주 동안 보관후 건조하여 최종 시편의 무게를 측정한후 무게변화를 측정하였다. 또한, pH 4.4, 5.4, 6.4, 7.4에서 2주와 4주 동안
보관한 시편 중 각 조건당 하나의 시편을 선택하여 주사 전자
현미경(SEM)으로 표면 특성을 관찰하였다. 주사 전자 현미경과 에너지
분산 분광법을 이용하여 CSC 표면의 형태학적 특성과 원소 조성을 분석하였다. 데이터의 통계 분석은 일원 분산 분석과 Tukey 사후 분석을 통해 통계적으로 검정되었다. 모든 통계적 유의 수준은 p < 0.05로 수행하였다.

3. 결과
세포 독성은 용출법으로 12시간, 24시간, 48시간 경화 후 측정하였다. 초기 및 최종 경화 시간은 OFPT, WRPT, pCSC 순으로 길었다. 용출법에서는 50% 희석된 pCSC 용출물이 세포 생존율을 유의하게 감소시킨 반면, OFPT와 WRPT는 12시간 경화 후 세포독성을 보이지 않았으며, 48시간 경화 후 75% 용출물 농도에서 OFPT는 세포독성을
보였지만 WRPT는 독성이 없는 것으로 나타났다. 이 연구에 사용된 퍼티형 CSC은 pCSC보다 낮은 세포독성을 보였으며, 이는 상대적으로 짧은 경화시간에 기인하는 것으로 판단된다. 생체 적합성과 관련하여, 다양한 pH 조건에서 세 가지 CSC 모두 초기 2주 동안 산성 환경에서 중량 감소를 보였으며, 이는 용해도가 증가했음을 시사한다. 그러나 pH4.4를 제외하고 다른 pH에서 4주 후 무게증가를 보였고, pH가 증가할수록 무게 증가가 관찰되었다. 그중 OFPT 및 WRPT는 pCSC에
비해 더 큰 무게 증가를 보였다. SEM 및 EDS 분석을 통해 확인된 바와 같이, 이러한 무게 증가는 calcium phosphate 침전물 형성에 기인하며, 다양한 표면 형태와 생물학적 활성 반응을 나타내는 원소
구성을 보여주었다. 퍼티형 시멘트에서 관찰된 향상된 침전은 polyethylene glycol과 같은 첨가물과 관련이 있을 수 있다. 퍼티형
CSC인 OFPT와 WRPT는 경화 시간이 짧고 조작성이 우수하며 산성
환경에서도 내구성이 뛰어나다는 장점이 있다. 이러한 특성은 염증으로 인해 산성화된 병변에 임상적용시 더 유용할 것으로 생각된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The purpose of this study was to observe the cytotoxicity
according to setting time of recently developed premixed putty type calcium silicate cements (CSC), namely One Fil PT (OFPT) and
Well Root PT (WRPT) compared with laboratory prepared powder
type CSC (pCSC), as well as the weight changes in various pH environments (pH 4.4, 5.4, 6.4, 7.4).
Initial and final setting times were measured. Extraction solutions
were prepared after 12, 24, and 48 hours of setting, and
cytotoxicity tests were conducted. After extraction, the solutions
were serially diluted with media to prepare extraction dilutions of
100, 75, 50, 25, and 10%. To observe weight changes and surface
characteristics in various acidic environments, phosphate buffered
saline solutions adjusted to pH 4.4, 5.4, 6.4, and 7.4 with HCl were
used as storage solutions. Specimens were stored at 37°C for 1, 2, 3, and 4 weeks, then dried to measure final weight and calculate
weight changes. Additionally, one specimen from each condition
stored for 2 and 4 weeks at pH 4.4, 5.4, 6.4, and 7.4 was selected for scanning electron microscopy (SEM) to observe surface
characteristics. SEM and energy dispersive spectroscopy (EDS)
were used to analyze the morphological characteristics and
elemental composition of the CSC surfaces. Statistical analysis of
the data was performed using one way analysis of variance and
Tukey's post hoc test. All statistical significance levels were set at p < 0.05.
Cytotoxicity was measured using the extraction method after 12, 24,
and 48 hours of setting. The initial and final setting times were
longest in OFPT, WRPT, and pCSC, in that order. In the extraction
method, 50% diluted pCSC extracts significantly reduced cell
viability, whereas OFPT and WRPT showed no cytotoxicity after 12
hours of setting. After 48 hours of setting, OFPT showed
cytotoxicity at 75% extract concentration, but WRPT exhibited no
toxicity. The putty type CSCs used in this study showed lower
cytotoxicity than pCSC, which is attributed to their relatively
shorter setting times. Regarding biocompatibility, all three CSCs
showed weight loss in acidic environments during the initial weeks,
suggesting increased solubility. However, except for pH 4.4, weight
increases were observed after 4 weeks at other pH levels, with
greater weight gain observed as pH increased. OFPT and WRPT
showed greater weight increases compared to pCSC. As confirmed
by SEM and EDS analysis, this weight increase was due to calcium
phosphate precipitate formation, showing various surface
morphologies and elemental compositions indicating biological
activity reactions. The enhanced precipitation observed in putty type cements may be related to additives such as polyethylene glycol.
The putty type CSCs, OFPT and WRPT, offer advantages of shorter
setting times, excellent handling properties, and durability even in
acidic environments. These characteristics suggest they would be
more useful for clinical applications in lesions acidified due to inflammation.

목차 (Table of Contents)

• 목차
• I. 서 론 1
• 1) Calcium silicate cements의 개발과 적용 1
• 2) Calcium silicate cements에서 vehicles의 역할 3
• 3) Calcium silicate cements의 물리화학적 특성에 미치는 pH의
• 영향 4
• II. 재료 및 방법 8
• 1) Calcium silicate cements 디스크 제조 및 용출 8
• 2) 경화시간 측정 9
• 3) 세포독성시험 (용출법) 10
• 4) 중량측정과 표면관찰 10
• 5) 통계분석 11
• III. 결 과 12
• 1) 경화시간 12
• 2) 세포독성시험 (용출법) 12
• 3) 중량측정 14
• 4) 표면관찰 17
• IV. 고 찰 25
• V. 결 론 31
• 참고문헌 32
• Abstract 43