효모에서 세포벽 무결성 경로가 복제성 수명에 미치는 영향 = Activation of cell wall integrity pathway limits replicative lifespan of Saccharomyces cerevisiae

국문 초록 (Abstract)

세포벽 무결성 경로는 효모에 존재하는 5개의 MAPK 경로 중 하나로, 다양한 자극을 수용하여 세포벽과 관련된 전반적인 반응을 조절하는 중요한 신호 전달 경로이다. 이러한 반응은 Sir3 단백질의 활성 억제, TORC1-Sch9과 cAMP-PKA 신호 전달 경로의 억제 등 효모의 복제성 수명에 큰 영향을 끼칠 수 있는 것을 포함하는데, 그 반응들이 복제성 수명에 끼치는 영향의 경향성이 일관되지 않아, 세포벽 무결성 경로와 복제성 수명 간의 관계는 명확히 밝혀져 있지 않았다. 본 연구는 효모의 세포벽 무결성 경로의 활성화가 세포의 복제성 수명을 어떻게 변화시키는지 확인하고, 그 기작을 분자적 수준에서 밝혔다. 세포벽 무결성 경로의 GTPase인 Rho1의 GTPase activating protein인 Sac7을 결실시켜 세포벽 무결성 경로를 활성화시켰을 때 복제성 수명이 감소함을 발견하였다. 이러한 복제성 노화는 세포벽 무결성 경로에 의존적으로 발생하였고, 주요 복제성 노화 요소인 ERCs, 산화적 손상을 받은 단백질 그리고 단백질 응집체들을 증가시키지 않으면서 발생함을 확인하였다. 또한 이러한 복제성 노화는 PKA 억제와 이로 인해 촉발되는 Rim15 - Igo1/2 - PP2ACdc55 경로에 의존적임을 규명하였다. 결과적으로 Sac7 결실로 인한 세포벽 무결성 경로의 활성화가 PP2ACdc55 탈인산화효소에 의해 발생하는 세포 주기 조절에 이상을 일으켜 복제성 노화를 일으킬 수 있다는 가능성을 제시하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The Cell Wall Integrity (CWI) pathway is one of the MAPK pathways in Saccharomyces cerevisiae, being the main route responsible for maintaining cell wall homeostasis. Moreover, CWI pathway regulates major factors of replicative aging, which include Sir3, TORC1, PKA, etc. However, the relationship between CWI pathways and replicative lifespan (RLS) has not been clearly elucidated because the impact of these factors does not consistently increase or decrease RLS.
In this study, I determined that activation of CWI pathway reduces RLS in a PP2ACdc55 - dependent manner. I determined that loss of Sac7, which is GTPase activating protein of Rho1, activated CWI pathway and induced replicative aging in a CWI pathway – dependent manner. I observed that this replicative aging induced by loss of Sac7 occurred without accumulation of extrachromosomal rDNA circles (ERCs), oxidatively damaged proteins, and protein aggregates, which are major factors of replicative aging. I also suggest the molecular mechanisms of replicative aging induced by loss of Sac7. In the absence of Sac7, Slt2, MAPK of CWI pathway, inhibited PKA activities by activating inhibitory subunit of PKA, Bcy1, thereby enhancing Rim15 – Igo1/2 pathway. Activated Igo1/2 inhibited activities of PP2ACdc55 phosphatase, which might impair cell cycle regulation and induce replicative aging. Taken together, my findings suggest that the increased CWI responses can cause replicative aging of S. cerevisiae in a Rim15 - Igo1/2 - PP2ACdc55 pathway.

목차 (Table of Contents)

• 초 록 ii
• 목 차 iii
• 표 목차 v
• 그림 목차 v
• 줄임말 정리 vi
• I. 서 론 1
• 1. 효모의 수명 1
• 2. 효모의 수명과 연관된 주요 신호 전달 경로 2
• 3. 세포벽 무결성 경로 4
• 4. 연구 목표 6
• II. 재료 및 방법 7
• 1. 효모 균주 및 배양 7
• 2. 형질전환 14
• 3. Western blot analysis 15
• 4. 복제성 수명 측정 16
• 5. 연대성 수명 측정 16
• 6. rDNA 전사 억제 측정 16
• 7. rDNA 안정성 측정 17
• 8. 세포 내 활성 산소종 측정 17
• 9. 산화적 손상을 받은 단백질 분석 17
• 10. Hsp104의 응집 관찰 18
• 11. 효모 세포의 핵상 관찰 18
• III. 결 과 19
• 1. 세포벽 무결성 경로를 조절하는 효소 19
• 2. Sac7과 Lrg1의 결실이 효모의 수명에 미치는 영향 21
• 3. Sac7 결실로 인한 rDNA 전사 억제와 안정성 변화 24
• 4. Sac7 결실로 인한 산화적 스트레스의 변화 26
• 5. Sac7 결실로 인한 단백질 응집체의 양 변화 28
• 6. Sac7 결실로 인한 복제성 수명 감소의 Sir3 비의존성 29
• 7. Sac7 결실로 인한 TORC1과 PKA의 활성 변화 31
• 8. Sac7 결실로 인한 복제성 수명 감소의 Rim15 의존성 33
• 9. Sac7 결실로 인한 복제성 수명 감소의 Igo1/2 의존성 35
• 10. Sac7 결실로 인한 복제성 수명 감소의 PP2ACdc55 탈인산화효소 복합체의 의존성 38
• 11. Sac7 결실 균주의 세포 주기 41
• IV. 논 의 43
• V. 참고문헌 48
• Abstract 51
• 표 목차
• [표 1] 본 연구에 사용한 효모 균주 목록 8
• [표 2] 본 연구에 사용한 프라이머 목록 11
• [표 3] 본 연구에 사용한 플라스미드 목록 15
• 그림 목차
• [그림 1] 효모 세포 수명의 개념 및 복제성 수명에 관여하는 3가지 요인 2
• [그림 2] 효모 세포에서 복제성 수명에 영향을 미칠 수 있는 신호 전달 경로 4
• [그림 3] 세포벽 무결성 경로와 복제성 수명 간의 관계 5
• [그림 4] 세포벽 무결성 경로의 활성화를 유도하는 결실 돌연변이주 20
• [그림 5] 세포벽 무결성 경로 돌연변이주의 수명 변화 22
• [그림 6] Sac7 결실 균주의 rDNA 전사 억제와 안정성 변화 25
• [그림 7] Sac7 결실 균주의 활성 산소종과 산화적 손상을 받은 단백질의 양의 변화 27
• [그림 8] Sac7 결실 균주의 Hsp104 단백질 응집 정도 28
• [그림 9] Sir3 결실 균주에서 Sac7을 추가로 결실시켰을 때 복제성 수명의 변화 30
• [그림 10] Sac7 결실에 따른 TORC1-Sch9과 cAMP-PKA 신호 전달 경로의 활성 변화 32
• [그림 11] Rim15이 Sac7의 결실에 의한 복제성 수명 감소에 미치는 영향 34
• [그림 12] Rim15의 인산화 표적들이 Sac7 결실로 인한 복제성 수명 감소에 미치는 영향 36
• [그림 13] 세포 주기 조절 인자들이 Sac7 결실로 인한 복제성 수명 감소에 미치는 영향 39
• [그림 14] Sac7과 Cdc55 결실에 따른 세포 주기 변화 42