Human Cytomegalovirus long non-coding RNA counteracts cGAS activity to evade host innate immunity = 인간거대세포바이러스의 긴 논코딩 RNA에 의한 cGAS 매개 면역 반응의 회피 기전 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Viruses have evolved to maintain compact genomes composed almost entirely of protein-coding genes, yet human cytomegalovirus (HCMV) expresses four long non-coding RNAs (lncRNAs), which account for more than half of the viral transcriptome. Despite their abundance, the roles of HCMV lncRNAs remain largely unknown. In this study, I newly found that RNA4.9, a 4.9 kb of HCMV lncRNA, inhibits nuclear cyclic GMP-AMP synthase (cGAS)-mediated immune response to facilitate viral replication. Cross-linking immunoprecipitation sequencing (CLIP-seq) analysis showed that RNA4.9 physically interacts with cGAS via a 75-nucleotide (nt) RNA region with predicted hairpin loops. Deleting the 75-nt region or sterically blocking its folding with antisense oligonucleotides (ASOs) during HCMV infection was sufficient to restore the cGAS activity, thereby impairing viral replication. Furthermore, I discovered that the unique localization of RNA4.9, which is locally accumulated near the nuclear HCMV DNA, correlates with its efficient binding to cGAS and subsequent immune suppression. These findings suggest viral long non-coding RNAs as critical regulators for host innate immune sensors and as potential therapeutic targets.

국문 초록 (Abstract)

바이러스는 대부분 단백질 암호화 유전자로 구성된 작은 크기의 유전체를 유지하도록 진화했지만, 인간거대세포바이러스(HCMV)는 바이러스 전사체의 절반 이상을 차지하는 네 개의 긴 비암호화 RNA(lncRNA)를 발현한다. 많은 발현량에도 불구하고, HCMV lncRNA의 역할은 아직까지 거의 보고된 바가 없다. 본 연구에서는 HCMV lncRNA 중 하나인 RNA4.9가 면역 센서 중 하나인 cGAS를 억제하여 숙주의 선천 면역 반응을 회피하고 바이러스의 복제를 촉진한다는 것을 밝혔다. CLIP-시퀀싱 분석 결과, RNA4.9는 75 뉴클레오타이드(nt)로 구성된 RNA 영역을 통해 cGAS와 물리적으로 상호작용하는 것이 확인되었으며, 이 지역은 헤어핀 구조를 가지는 것으로 예측되었다. 특히, HCMV 감염 상황에서 cGAS-결합 헤어핀 지역을 삭제하는 것 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)를 사용하여 해당 지역의 RNA 구조를 입체적으로 차단하게 되면, cGAS의 과활성을 유도하여 바이러스 복제를 저해할 수 있음이 확인되었다. 또한 핵 내부 HCMV DNA 근처에 국소적으로 축적되는 RNA4.9의 독특한 세포 내 위치가 cGAS와의 효율적인 결합 및 이에 따른 면역 억제기능과 상관 관계가 있음이 확인되었다. 본 연구의 결과는 바이러스의 lncRNA가 숙주 선천 면역센서에 대한 주요 조절자로 기능하며 잠재적인 치료 표적으로 활용될 수 있음을 제시한다.

목차 (Table of Contents)

• CONTENTS I
• LIST OF TABLE AND FIGURES III
• LIST OF ABBREVIATIONS VIII
• 1. ABSTRACT 1
• 2. INTRODUCTION 3
• 2.1. Viral immune evasion 3
• 2.2. HCMV long non-coding RNAs 4
• 2.3. The role of cGAS in host innate immunity 6
• 2.4. The role of HCMV long non-coding RNA4.9 in cGAS inhibition 10
• 3. MATERIALS AND METHODS 11
• 3.1. Cells and Viruses 11
• 3.2. Recombinant viruses 12
• 3.3. Quantitative PCR (qPCR) and reverse transcription-qPCR (RT-qPCR) 14
• 3.4. mRNA sequencing 14
• 3.5. Human Cytokine array 15
• 3.6. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) 15
• 3.7. Transfection 15
• 3.8. Immunoblotting 16
• 3.9. RNA interference 18
• 3.10. Nucleus/cytoplasm fractionation 18
• 3.11. Viral DNA staining 18
• 3.12. Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) and immunofluorescence assay (IFA) 19
• 3.13. Analysis of localization signals 21
• 3.14. RNA-immunoprecipitation (RNA-IP) 21
• 3.15. Cross-linking and immunoprecipitation (CLIP) library or size-matched-input (SMI) library construction 23
• 3.16. CLIP-sequencing analysis 26
• 3.17. Detection of predominant cGAS-binding sites within HCMV transcripts 27
• 3.18. Data and Code availability 28
• 4. RESULTS 36
• 4.1. HCMV RNA4.9 suppresses innate immune responses during lytic infection 36
• 4.2. RNA4.9 targets cGAS to inhibit antiviral response 58
• 4.3. RNA4.9 restricts nuclear cGAS activity 70
• 4.4 RNA4.9 interacts with cGAS through a 75-nt domain with predicted hairpin loops 74
• 4.5. The cGAS-binding hairpin region of RNA4.9 is critical for cGAS inhibition and promoting HCMV lytic replication 88
• 4.6. RNA4.9 locally accumulates in the vicinity of nuclear HCMV DNA at 6 hpi 105
• 4.7. RNA4.9 localization is determined by its 3.0-4.0k region and correlates with cGAS inhibition 110
• 4.8. Localization of RNA4.9 is correlated with efficient binding to cGAS 126
• 5. DISCUSSION 132
• 6. REFERENCES 138
• 7. ABSTRACT IN KOREAN 151
• 8. APPENDICS 153