Development of epigenetic age prediction models and targeted sequencing methods for costal cartilage = 늑연골의 후생유전학적 연령 추정 모델 및 타겟 시퀀싱 기법 개발

국문 초록 (Abstract)

대량 재해나 범죄 수사에서 신원 불상의 시신이 발견되었을 때, 지문 등으로 신원 확인이 불가능한 경우에는 연령 추정을 통해 변사자 또는 피해자의 범위를 효과적으로 축소할 수 있다. DNA 기반 연령 예측 기법 중에서도, 노화와 관련이 있는 CpG 부위의 DNA 메틸화 수준을 분석하여 활용하는 방법은 높은 정확성과 신뢰성을 인정받아왔다.
변사자의 경우, 부패 상태에 따라 DNA 분석에 적합한 시료의 선택이 달라질 수 있다. 부패 초기에는 골격근과 같은 연조직이 우선적으로 사용되지만, 연조직이 심하게 손상된 경우에는 연골, 뼈, 치아와 같은 대체 조직이 필요하다. 지금까지 다양한 조직을 대상으로 DNA 메틸화 기반의 연령 예측 연구가 수행되어 왔으나, 부패된 시신에서 확보할 수 있는 조직을 대상으로 한 연구는 제한적이다. 본 연구는 연령 관련 DNA 메틸화 마커를 활용하여 늑연골을 대상으로 한 연령 예측 모델 및 분석 시스템을 개발하는 것을 목표로 한다.
본 논문은 대량 병렬 시퀀싱(MPS)과 스냅샷(SNaPshot) 분석법을 활용하여 늑연골 연령 예측 모델을 개발한 두 가지 플랫폼의 연구로 구성된다.
첫 번째 연구에서는 MPS 분석을 위해 9개 유전자(TMEM51, MIR29B2CHG, EDARADD, FHL2, TRIM59, ELOVL2, KLF14, ASPA 및 PDE4C)에 대해 두 번의 다중 중합효소 연쇄반응을 수행하여 MPS 라이브러리를 제작하였다. 한국인 사망자(26~89세)로부터 확보한 85개의 늑연골 시료로부터 총 45개의 CpG 부위에 대한 DNA 메틸화 수준을 측정하였으며, 전체 시료를 학습 세트(Training set)로 단계적 회귀 분석을 수행하여 연령 예측 모델을 구축하였다. 그 결과, MIR29B2CHG, FHL2, TRIM59, ELOVL2, KLF14 및 ASPA 유전자에 위치한 9개의 CpG 부위가 동반된 최종 모델이 구축되었다. 해당 모델의 성능을 평가하기 위하여LOOCV(leave-one-out cross-validation) 교차 검증을 수행한 결과, 평균 절대 오차(MAE)는 4.97년, 평균 제곱근 오차(RMSE)는 6.43년으로 나타나 높은 예측 정확도를 보였다.
두 번째 연구에서는 모세관 전기영동 기반의 SNaPshot 분석법을 활용하여 늑연골 을 대상으로 한 연령 예측 모델 및 분석 시스템을 개발하였다. 한국인 사망자(28~84세)로부터 확보한 136개의 늑연골 시료에서 6개 유전자의 11개 CpG 부위에 대한 DNA 메틸화 수준을 측정하였다. 해당 11개 CpG 부위는 본 논문의 첫 번째 연구와 이전에 유럽에서 보고된 MPS 기반의 늑연골 대상 연구의 예측 모델에 활용된 마커이다. 이 중 83개 시료를 학습 세트로 사용하여 회귀 분석 방법을 통해 5가지의 예측 모델을 구축하였고, 나머지 53개 시료를 검증 세트(test set)로 사용하여 각 모델의 성능을 평가 및 비교하였다. 실험의 효율성을 고려하여 4개의 CpG 부위(MIR29B2CHG_C2, FHL2_C4, TRIM59_C3 및 KLF14_C)로 구성된 모델을 최적의 연령 예측 모델로 선정하였고, 이 모델을 검증 세트에서 평균 절대 오차4.60년, 평균 제곱근 오차 5.41년으로 높은 정확도를 나타냈다.
최종적으로, 본 연구에서는 최적 모델에 포함된 4개의 CpG 부위를 분석할 수 있는 다중 SNaPshot 시스템을 개발하였다. 이 시스템의 민감도 및 다양한 조직에서의 적용 가능성 실험 결과, 예측 정확성과 신뢰성을 확보하기 위해서는 최소 4ng의 중아황산염(bisulfite) 변환 DNA가 필요하고, 본 시스템이 혈액 및 구강 면봉에서도 적용 가능할 수 있음을 관찰하였다. 그리하여, 본 연구에서 개발된 연령 예측 모델 및 분석 시스템은 변사자 시료로부터 사망 시점의 연령 추정을 통해 대량재해 혹은 범죄 수사 등의 법과학적 조사에서 실종자 및 피해자의 신원 확인에 효과적으로 기여할 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Estimating the age at death can be crucial for narrowing the pool of potential donors in mass disasters and criminal investigations. Among DNA-based age prediction methods, assessing DNA methylation levels at age-associated CpG sites has been recognized as a highly accurate and reliability.
In the case of deceased, the choice of sample for DNA analysis largely depends on the stage of decomposition. While soft tissues such as skeletal muscle are preferred in the early stages of decomposition, alternative tissues such as cartilage, bone, and teeth become necessary when soft tissues are extensively degraded. Although DNA methylation-based age prediction has been explored in various tissues, studies focusing on tissues from decomposed bodies remain limited. This research aims to develop an age prediction tool specifically targeting costal cartilage by utilizing DNA methylation markers associated with aging.
This dissertation comprises two studies that employ different analytical platforms, massive parallel sequencing (MPS) and the SNaPshot assay, to develop predictive models for costal cartilage.
In the first study, an MPS library was prepared by two rounds of multiplex polymerase chain reaction (PCR) of nine genes (TMEM51, MIR29B2CHG, EDARADD, FHL2, TRIM59, ELOVL2, KLF14, ASPA, and PDE4C), which are closely associated with bone aging. DNA methylation levels at 45 CpG sites within these nine genes were examined in 85 costal cartilage samples obtained from deceased Koreans aged 26–89 years. Stepwise regression analysis was then performed using methylation data from the entire set of samples as the training set to construct an age prediction model. Through MPS analysis, nine CpGs located in MIR29B2CHG, FHL2, TRIM59, ELOVL2, KLF14, and ASPA were selected for model construction. Model performance was evaluated using leave-one-out cross-validation, yielding high accuracy with a mean absolute error (MAE) of 4.97 years and a root mean square error (RMSE) of 6.43 years.
In the second study, a capillary electrophoresis-based SNaPshot assay (targeted sequencing methods) was developed for age prediction of costal cartilage and used to analyze DNA methylation at 11 CpG sites across six genes in 136 samples from deceased Koreans aged 28 to 84 years. These 11 CpG sites are markers used in the model from the first study of this dissertation and a previous MPS-based study on costal cartilage reported in Europe. To construct the predictive model, DNA methylation levels at these sites were analyzed in a training set of 83 samples using stepwise regression in five different approaches. Performance parameters were then compared between the training set and a testing set of 53 samples. Considering experimental simplicity, a model incorporating four CpGs (MIR29B2CHG_C2, FHL2_C4, TRIM59_C3, and KLF14_C3) was selected as the optimal age prediction model, demonstrating high accuracy with a mean absolute error of 4.60 years and a root mean square error of 5.41 years in the testing set.
Ultimately, a multiplex SNaPshot system was developed to analyze the four CpG sites included in the optimal model. It was found that at least 4 ng of bisulfite-converted DNA is required for prediction accuracy and reliability, and that this system can also be applied to blood and buccal swabs. The age prediction tool developed in this dissertation is expected to contribute to the identification of missing persons and victims in forensic investigations, such as those involving mass disasters or criminal investigations, by estimating the age at death from deceased samples.

목차 (Table of Contents)

• Abstract ⅰ
• Table of Contents. ⅳ
• List of Tables ⅶ
• List of Figures ⅸ
• General Introduction 11
• Study Objective 11
• DNA Approaches for Age Prediction 12
• Costal Cartilage 13
• DNA Methylation-Based Age Prediction for Human Remains 14
• Chapter 1. Massive Parallel Sequencing-Based Age Prediction Model for Costal Cartilage 16
• 1.1. Introduction 17
• 1.2. Materials and Methods 18
• 1.2.1. Samples 18
• 1.2.2. DNA Extraction and Bisulfite Conversion 18
• 1.2.3. MPS Library Construction 19
• 1.2.4. DNA Methylation Measurement using MPS 22
• 1.2.5. Regression Modeling for Age Prediction 22
• 1.2.6. Cross-Validation and Performance Metrics 23
• 1.3. Results 26
• 1.3.1. DNA Quantification and MPS Coverage 26
• 1.3.2. Correlations Between DNA Methylation and Age 28
• 1.3.3. Age Prediction Model Construction and Validation 28
• 1.4. Discussion 35
• 1.5. Conclusions 39
• Chapter 2. Development of Age Prediction System for Costal Cartilage through SNaPshot Assay 40
• 2.1. Introduction 41
• 2.2. Materials and Methods 42
• 2.2.1. Samples 42
• 2.2.2. DNA Extraction 42
• 2.2.3. Bisulfite Conversion and Multiplex PCR 43
• 2.2.4. Single Base Extension (SBE) Reaction 46
• 2.2.5. Statistical Analysis and Age Prediction Construction 48
• 2.2.6. Sensitivity Test 49
• 2.2.7. Multiple Tissue Applicability 50
• 2.3. Results 51
• 2.3.1. Methylation Levels and Correlations with Age 51
• 2.3.2. Age Prediction Model Construction and Validation 59
• 2.3.3. SNaPshot Multiplex System and Sensitivity Test 67
• 2.3.4. Multiple Tissue Applicability 69
• 2.4. Discussion 76
• 2.5. Conclusions 83
• Bibliography 84
• Abstract in Korean 94
• Acknowledgements 97
• 감사의 글 99