Contextual regulation of GPCR signaling and its application in diagnostic and oncogenic models = GPCR 신호전달의 세포 맥락 의존적 조절과 진단 및 종양 모델에서의 응용

국문 초록 (Abstract)

G 단백질 연결 수용체(GPCR, G protein-coupled receptor)는 세포막 단백질 중 가장 기능적으로 유연하고 다양성이 높은 계열로, 이질삼합체 G 단백질과의 결합을 통해 매우 광범위한 생리적 반응을 매개한다. 전통적으로는 각 GPCR이 특정 G 단백질과 결합하는 정형적 신호 경로에 초점이 맞춰져 있었으나, 최근 연구들은 다양한 G 단백질 경로 간의 동적 상호작용(crosstalk)과 세포 유형 및 생리적 상태에 따른 맥락 의존적 조절(context-dependent modulation)이 GPCR 기능 해석에 있어 결정적임을 보여주고 있다. 이러한 기능적 가소성은 GPCR이 진단과 병리학 양 측면에서 매우 유망한 타깃이 될 수 있음을 시사함과 동시에, 그 복잡성으로 인해 신호 해석 및 응용에 새로운 도전 과제를 제시한다. 특히, 하나의 리간드가 여러 GPCR에 결합할 수 있기 때문에, 특정 생물학적 조건에서 리간드의 농도와 GPCR 발현 패턴을 함께 고려하는 것이 GPCR 신호전달 결과를 정확히 이해하는 데 필수적이다. 본 학위논문은 이러한 GPCR 신호의 맥락 의존성을 활용하여 수행된 두 가지 상이하지만 개념적으로 연결된 연구를 다룬다. 첫 번째 연구는 Gαi와 Gαq 경로 간의 기능적 상호작용을 기반으로, 백일해 독소(Pertussis toxin, PTx)를 정량적으로 탐지할 수 있는 칼슘 기반 진단 플랫폼을 개발하였다. Gαi 억제로 인해 Gαq 경로가 증폭된다는 관찰에 기반하여, HRH1 수용체를 통한 칼슘 신호를 민감한 readout으로 사용하는 분석법을 설계하였다. 본 플랫폼은 기존의 클러스터링 기반 또는 cAMP 기반 검출법에 비해 높은 특이도, 재현성, 고처리량 분석 적합성을 제공하며, 전사체 분석을 통해 사용된 세포주에서 HRH 계열 중 HRH1이 가장 높게 발현됨을 확인하여 타깃 선정의 근거를 마련하였다. 또한, HRH1이 Gαi와 Gαq 양쪽 모두에 결합할 수 있는 G 단백질 결합 다형성(coupling diversity)을 지닌다는 점이 분석 민감도 향상에 중요한 역할을 하였으며, 이는 수용체 발현 패턴과 신호전달 유연성을 동시에 고려한 진단 응용의 한 예로 작용하였다. 두 번째 연구에서는 Gαs 결합 수용체인 ADORA2B가 삼중음성 유방암(triple-negative breast cancer, TNBC)에서 저산소 적응 및 면역관문 조절에 중심적인 역할을 수행함을 규명하였다. 벌크 및 단일세포 RNA-seq, 3차원 종양 스페로이드 모델링, 기능적 차단 실험을 통합한 결과, ADORA2B–PKA–UBE2S–β-catenin–HIF-1α로 이어지는 자기 강화형 신호축이 확인되었으며, 이는 정상 산소 또는 간헐적 저산소 조건에서도 저산소 전사 프로그램을 지속시키는 기능적 회로로 작용한다. ADORA2B는 실험에 사용된 세포 모델에서 ADORA 계열 중 가장 높게 발현되었으며, hypoxia 조건에서 증가한 세포외 아데노신에 의해 활성화되었다. 이 회로는 feed-forward 기전(β-catenin을 통한 HIF-1α 증폭)과 positive feedback 기전(HIF-1α가 ADORA2B 발현을 촉진)을 동시에 포함하며, 회로 차단 시 PD-L1 발현 감소 및 저산소 신호의 억제를 유도하여 면역회피 조절의 치료적 가능성을 제시한다. 결론적으로 본 논문은 GPCR 신호의 맥락 의존적 특성—즉 리간드 가용성, 수용체 발현, G 단백질 결합 유연성—이 진단 및 종양 신호 분석 모두에서 전략적으로 활용될 수 있음을 실증적으로 제시한다. 분석 플랫폼 개발과 종양 적응 기전 해석을 연결함으로써, GPCR의 기능적 다양성에 대한 정교한 이해는 생의학적 응용은 물론 질병 이해의 정밀도를 높이는 데 있어 핵심적인 역할을 할 수 있음을 본 연구는 제시하고 있다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute one of the most functionally versatile families of membrane proteins, mediating a wide spectrum of physiological responses through coupling with distinct classes of heterotrimeric G proteins. While traditionally studied in isolated signaling contexts, recent findings underscore the dynamic crosstalk and context-dependent modulation among different G protein pathways. This functional plasticity presents both opportunities and challenges in understanding GPCRs in diagnostic and pathological settings. Moreover, since a single ligand can activate multiple GPCR subtypes, accurate characterization of both ligand abundance and receptor expression patterns is essential to deciphering the biological outcome of GPCR signaling in a given context. This dissertation presents two distinct but conceptually connected studies that leverage the contextual nature of GPCR signaling in both diagnostic assay development and oncogenic pathway analysis. The first study establishes a functional calcium-based assay for pertussis toxin (PTx) detection by exploiting the crosstalk between Gαi and Gαq signaling. Building on observations that Gαi inactivation enhances calcium signaling through Gαq-coupled receptors, I developed a sensitive and reproducible assay using HRH1-mediated calcium responses as a quantitative readout. This platform improves upon traditional clustering or cAMP-based assays, offering enhanced specificity, reproducibility, and high-throughput compatibility. Transcriptomic profiling identified HRH1 as the dominantly expressed histamine receptor in the assay system, validating its selection. Equally critical was the recognition that HRH1 can couple to both Gαi and Gαq, enabling the deliberate use of G protein coupling diversity to amplify assay performance—demonstrating how receptor expression and signaling flexibility can be jointly harnessed in diagnostic contexts. The second study investigates the role of ADORA2B, a Gαs-coupled receptor enriched in triple-negative breast cancer (TNBC), in promoting hypoxia-adaptive transcriptional programs and immune checkpoint regulation. Multi-omics analyses—including bulk and single-cell RNA-seq, 3D tumor spheroid modeling, and functional perturbation—identified a self-reinforcing ADORA2B–PKA–UBE2S–β-catenin–HIF-1α axis that sustains hypoxic signaling even under normoxic or fluctuating oxygen conditions. ADORA2B was found to be the most abundantly expressed adenosine receptor in the same model, and its activation is driven by elevated extracellular adenosine under hypoxia. This axis integrates a feed-forward mechanism, where ADORA2B amplifies hypoxia signaling via β-catenin–HIF-1α cooperation, and a positive feedback loop, where HIF-1α transcriptionally upregulates ADORA2B. Disruption of this circuit attenuated hypoxia-responsive gene expression and reduced PD-L1 levels, suggesting a viable therapeutic target for modulating immune evasion. Taken together, these studies illustrate how contextual features of GPCR signaling—ligand availability, receptor expression, and G protein coupling versatility—can be strategically leveraged to develop innovative diagnostic platforms and dissect oncogenic adaptation mechanisms. By bridging assay engineering with tumor biology, this dissertation highlights the broader implications of GPCR functional plasticity in biomedical research and clinical translation.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT i
• CONTENTS iv
• LIST OF FIGURES AND TABLES 1
• CHAPTER Ⅰ 4
• Introduction 4
• 1. Overview of G protein-coupled receptors (GPCRs) 5
• 1.1 Molecular architecture and signal transduction of GPCRs 5
• 1.2 Industrial and biomedical trends of GPCRs 6
• 1.3 Diagnostic applications and therapeutic targeting of GPCRs 6
• 2. Overview of GPCR signaling 8
• 2.1. Calcium signaling 8
• 2.2. cAMP signaling 9
• 2.3 Functional versatility of GPCR signaling 10
• 3. Previous studies on GPCR signaling 11
• 4. Aim of this study 12
• CHAPTER Ⅱ 14
• Sensitive detection of pertussis toxin in acellular pertussis vaccines using HRH1-mediated calcium signaling 14
• 1. Introduction 15
• 2. Results 19
• 2.1. HRH1 primarily couples with and activates Gαq heterotrimers compared to LPAR1 and ADORA2B 19
• 2.2. Effect of PTx on calcium signaling mediated by HRH1, LPAR1, and ADORA2B in MDA-MB-231 cells 23
• 2.3. PTx enhances histamine/HRH1-induced Gαq activation and its association with PLCβ, leading to an increase in sustained calcium signaling 30
• 2.4. Evaluation of the analytical performance of the histamine/HRH1-induced calcium assay for PTx detection 37
• 2.5. Application of a Histamine/HRH1-induced calcium assay for detecting PTx in commercial aP vaccine 42
• 3. Discussion 45
• 4. Materials and Methods 53
• CHAPTER Ⅲ 58
• Investigation of the role of ADORA2B in the progression of triple-negative breast cancer 58
• 1. Introduction 59
• 2. Results 61
• 2.1. ADORA2B is highly expressed in TNBC and associated with hypoxia and poor prognosis 61
• 2.2. ADORA2B expression correlates with disease recurrence and tumor hypoxia in breast cancer 65
• 2.3. ADORA2B is the dominant functional adenosine receptor in MDA-MB-231 cells and signals via Gαs 68
• 2.4. Transcriptomic Response to Adenosine in MDA-MB-231 Cells 71
• 2.5. Integration of in vitro and in vivo datasets reveals ADORA2B-linked hypoxia transcriptional signatures 75
• 2.6. Single-cell transcriptomics reveals ADORA2B-expressing cell subpopulations enriched in triple-negative and metaplastic breast cancer 83
• 2.7. ADORA2B–cAMP–PKA signaling regulates UBE2S expression independently of HIF1A induction 91
• 2.8. ADORA2B-PKA axis promotes UBE2S expression and β-catenin activation in MDA-MB-231 cells 94
• 2.9. PKA is a critical downstream effector of ADORA2B-mediated hypoxia signaling in 3D tumor spheroids 97
• 2.10. Knockdown of UBE2S, β-catenin, or HIF1A reduces hypoxia reporter activity and associated protein levels in MDA-MB-231 spheroids 101
• 2.11. ADORA2B knockdown suppresses hypoxia-induced gene expression and impairs 3D spheroid viability 105
• 2.12. UBE2S expression is clinically associated with hypoxia signaling and poor prognosis in breast cancer patients 109
• 3. Discussion 113
• 4. Materials and Methods 118
• CONCLUSION 125
• REFERENCES 129
• ABSTRACT IN KOREAN 144