Clinical Application of Next-Generation Sequencing for Nontuberculous Mycobacteria: Species Identification and Antimicrobial Resistance Prediction = 비결핵항산균에 대한 차세대염기서열분석의 임상 적용: 종동정 및 항균제 내성 예측

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background: Accurate identification and drug susceptibility testing (DST) of nontuberculous mycobacteria (NTM) are critical for the management of NTM pulmonary disease. Conventional methods such as Sanger sequencing and line probe assays have limited discriminatory power and scope. This study aimed to evaluate the feasibility of implementing next-generation sequencing (NGS) for routine NTM identification and genotypic resistance prediction in a clinical microbiology laboratory.
Methods: The study was conducted in four phases: (1) evaluation of DNA extraction methods, (2) a pilot phase assessing rare or inconclusive isolates, (3) a comparative evaluation with Sanger sequencing (n=106), and (4) routine diagnostic application (n=236). NGS was performed using the NovaSeq 6000Dx platform (Illumina, USA), and taxonomic classification was based on Kraken2 and Bracken, followed by de novo genome assembly and average nucleotide identity (ANI) analysis. Genotypic resistance to clarithromycin and amikacin was predicted using known mutations in rrl, rrs, and erm(41).
Results: In the comparative evaluation phase, genome-based identification showed 91.4% concordance with Sanger sequencing (96/106). NGS identified mixed Mycobacterium infections (3.8%), rare species (4.7%), and a non-mycobacterial organism (0.9%) that were not detected by Sanger sequencing. Among 78 isolates of M. avium, M. intracellulare, and M. abscessus complex, genotypic predictions for clarithromycin and amikacin showed 100% concordance with phenotypic DST. In the routine diagnostic phase, NGS was applied to 236 isolates. A single Mycobacterium species was identified in 226 cases (95.8%), mixed infections in 2 cases (0.8%), and non-mycobacterial organisms in 8 cases (3.4%). The most common species were M. intracellulare (37.7%) and M. avium (31.8%). Among 160 isolates with DST data, genotypic-phenotypic concordance for clarithromycin was 100% in M. avium and M. massiliense, 99.1% in M. intracellulare, and for amikacin, 100%, 100%, and 97.4%, respectively. Inducible macrolide resistance in M. abscessus was also accurately predicted by erm(41) alleles. NGS reduced time from specimen receipt to test initiation (median 6 vs. 9 days, P < 0.001), but required more time for post-sequencing analysis. Total turnaround time was comparable to Sanger sequencing (median 14 vs. 13 days, P = 0.065).
Conclusions: NGS provides comprehensive species-level identification and accurate genotypic resistance prediction for NTM and can be integrated into routine clinical diagnostics with turnaround times similar to conventional methods.

국문 초록 (Abstract)

배경: 비결핵항산균 폐질환(NTM-PD)의 적절한 치료를 위해서는 정확한 종 수준 동정 및 약제 감수성 검사(DST)가 필수적이다. 기존의 동정 방법인 Sanger sequencing과 line probe assay(LPA)는 구분력이 제한적이며 동정 가능한 균주의 수가 제한되어 있다. 본 연구에서는 임상 미생물 검사실에서 차세대염기서열분석(NGS)을 NTM 동정 및 유전형 기반 내성 예측에 적용하고 그 임상적 유용성을 평가하고자 하였다.
방법: 연구는 4단계로 구성되었으며, (1) 핵산 추출법 비교, (2) 희귀 균주 또는 동정 실패/내성 균주를 포함한 시범 분석, (3) Sanger sequencing과 병행한 비교 분석(n=106), (4) 정규 진단에 적용한 분석(n=236)으로 구성되었다. NGS는 NovaSeq 6000Dx 플랫폼(Illumina, USA)을 사용하여 수행되었으며, 분류학적 분류는 Kraken2 및 Bracken을 기반으로 하였고, 이후 de novo genome assembly 및 평균 뉴클레오타이드 유사도(ANI) 분석을 통해 종 수준 동정을 수행하였다. Clarithromycin 및 amikacin에 대한 유전형 내성 예측은 rrl, rrs, erm(41) 유전자의 알려진 변이를 기반으로 하였다.
결과: 비교 분석 단계에서 NGS 기반 동정은 Sanger sequencing과 91.4%의 일치율(96/106)을 보였다. NGS를 통해 혼합 감염(3.8%), 희귀 균주(4.7%), 비-Mycobacterium 균주(0.9%)가 추가로 확인되었다. M. avium, M. intracellulare, M. abscessus complex를 포함한 78균주에서 clarithromycin 및 amikacin에 대한 유전형 기반 예측은 표현형 DST와 100% 일치하였다. 정규 진단 단계에서는 총 236균주에 대해 NGS를 적용하였으며, 단일 Mycobacterium 종은 226건(95.8%), 혼합 감염은 2건(0.8%), 비-Mycobacterium 균주는 8건(3.4%)에서 확인되었다. 가장 흔한 종은 M. intracellulare (37.7%)와 M. avium (31.8%)이었다. DST 결과가 있는 160균주 중, clarithromycin에 대한 유전형-표현형 일치율은 M. avium 및 M. massiliense에서 100%, M. intracellulare에서 99.1%였으며, amikacin에 대해서는 각각 100%, 100%, 97.4%였다. 또한 M. abscessus에서의 macrolide 유도내성은 erm(41) allele 분석을 통해 정확히 예측되었다. 검체 수령부터 검사 시작까지 소요 시간은 NGS에서 유의하게 짧았고(중앙값 6일 vs. 9일, P < 0.001), 전체 검사 소요 시간은 두 방법 간 유의한 차이를 보이지 않았다(중앙값 14일 vs. 13일, P = 0.065).
결론: NGS는 NTM의 종 수준 동정 및 유전형 기반 내성 예측에 효과적이며, 기존 진단 체계에 통합이 가능하고 검사 소요 시간도 기존 방법에 비해 유사한 수준이었다.

목차 (Table of Contents)

• Introduction 1
• Methods 3
• Results 12
• Dicussion 39
• References 44
• Abstract in Korean 49